来源： 刘，X. 等细菌叶片浸润法用于精细表征植物防御反应 拟南芥-丁香假单胞菌 病理系统 视觉实验杂志. (2015).
本视频演示了一种评估感染了Pseudomonas syringae的拟南芥（Arabidopsis thaliana）叶片中细菌载量的方法。取自感染叶片的叶圆片经匀浆处理后进行系列稀释，并接种于营养丰富的琼脂培养基上以促进细菌菌落形成。通过计数菌落并计算每片叶圆片的菌落形成单位（CFU），从而对感染程度进行定量评估。
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评估 Pseudomonas syringae 感染负荷在 拟南芥 叶片
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2026年7月1日
本文内容
摘要
方案
以下文本描述了一种在拟南芥中进行优化的Psm ES4326 注射式侵染实验的逐步操作方案。该实验的主要步骤以简化的流程图表示（图1）。
1. 植物生长条件
- 播种种子
- 准备2个花盆（直径4英寸，高3.75英寸），松散地装入土壤，并在播种前通过底部浸泡过夜（O/N）进行浇水，之后排去多余水分。
- 使用折叠的70 mm称量纸或其他纸张，将50–100粒拟南芥种子（野生型Col-0或npr1-1突变体）播种于每个花盆中。
- 用喷水后的透明罩盖住花盆，使相对湿度升至80–90%（图2A）。
- 将花盆置于4 °C条件下孵育72小时，以完成充分的层积处理并实现同步萌发。
- 将花盆转移至标准生长条件（12小时光照/12小时黑暗，21 °C，光照强度100 µmol/m2/sec，相对湿度40%），以促进种子萌发。转移至生长室后立即打开透明罩，形成2–3英寸的开口，有助于避免水分凝结。
- 当第一片真叶长至2–3 mm长时，将幼苗从花盆移栽至装有土壤的72孔育苗盘中。
- 用手指或1 ml移液器吸头在育苗盘土壤表面中央压出约1英寸深的凹坑。
- 尽可能轻柔地分离单株幼苗，减少根部损伤。使用镊子小心夹取根系完整的幼苗。
- 将单株分离的幼苗连同附着的土块一起放入凹坑中，以尽量减少移栽胁迫；然后轻轻压实周围土壤，填满凹坑。将多余的幼苗和土壤丢弃至生物危害废物容器中，并按照当地生物危害废物处理规范进行处置。
- 从上方浇水，并用喷水后的透明罩完全覆盖育苗盘，以维持80–90%的湿度。保持罩盖3天，第4天早晨打开罩子通风，当天结束前完全移除罩子。
注意：播种也可采用替代方法，即将种子在含1 ml 0.1%琼脂的1.5 ml离心管中于4 °C层积处理48小时，随后用玻璃移液器将2–3粒种子转移至装有土壤的72孔育苗盘中。育苗盘需覆盖透明罩，可在萌发后一周移除。可去除多余幼苗，使每孔仅保留一株幼苗。
- 每隔两天将育苗盘浸入1英寸深的水中20分钟进行浇水，之后排去多余水分。
注意：浇水间隔时间取决于生长室的湿度，需根据用户所在植物生长设施的实际情况通过持续观察确定。每天检查植株，确保水分充足。若仅有局部区域变干，可使用喷雾瓶从上方对这些植株进行补水。 - 在植株处于或接近发育阶段#3.50（莲座丛大小达到最终大小的50%）时进行病原菌侵染实验（步骤3–5），该阶段通常对应3–5周龄，具体时间取决于生长条件（光周期、温度）。由于年龄相关抗性的出现，不得在花序出现后（阶段#5）进行侵染实验。
2. 培养基与培养板的制备
- 配制1 L KB（King’s B）液体培养基。在1,000 ml去离子H2O中加入20 g蛋白胨和2 g磷酸氢二钾三水合物，使用磁力搅拌子轻轻搅拌，直至无可见沉淀物。将溶液分装至150 ml玻璃瓶中，每瓶100 ml，并在液体程序下高压灭菌20分钟。
- 制备含KB固体培养基的培养皿。
- 在1,000 ml去离子H2O中加入20 g蛋白胨、2 g磷酸氢二钾三水合物和15 g琼脂，轻轻搅拌混匀，随后进行高压灭菌。
- 将培养基置于磁力搅拌台上冷却至触感微凉，以减少后续冷凝并避免抗生素降解。向培养基中加入18 ml无菌80%甘油和5 ml无菌1 M硫酸镁（MgSO4）。由于Psm ES4326具有链霉素抗性，需向冷却后的培养基中加入链霉素，使其终浓度为50 µg ml−1。
- 倾注平板。准备两种规格的KB培养基平板：100 mm × 15 mm和150 mm × 15 mm的培养皿。较小的培养皿用于初级细菌培养，较大的培养皿用于细菌计数。
注意：对于细菌计数平板，可使用矩形平板以降低耗材成本，因为与传统圆形平板相比，每块平板可容纳两倍数量的处理组。- 在感染实验前预先倾注平板。KB培养基平板可于4 °C保存2–3个月，因硫酸链霉素会逐渐丧失其抗菌活性。
增强的疾病易感性（EDS）
- 第1天 - 在平板上划线接种细菌
- EDS 检测前两天，划线 Psm 从-80 °C甘油菌种中接种ES4326至KB-Strep细菌培养平板，28 °C培养24–48小时。
- 第2天 - 启动液体培养并给植物浇水
- 在无菌试管中加入含50 µg/ml抗生素的4 ml液体KB培养基，启动液体培养−1 链霉素，250 rpm、28 °C 振荡过夜。
注意：对于EDS感染实验，建议每种基因型使用6株植物。对于STI和MTI实验，建议每种基因型每种处理使用6株植物。对于细菌接种液，建议使用新鲜的液体培养物，其在λ处的光密度600 nm 介于 0.3 和 0.6 之间。 - 用钝头防水记号笔标记第5和第6片叶片的叶柄，以便在取样时易于识别受感染组织（图1通过从底部浸泡育苗盘20分钟，充分浇水以促进气孔开放并利于病原菌溶液进入叶片，然后排出多余的水分。
注意：或者，用透明罩盖住培养皿，并将其浸入水中2-4小时，以促进气孔开放。 - 第3天 - 病原体稀释与注射器浸润
注意病原体在早晨时段感染最有利于其增殖，并在易感基因型上引发最显著的病症。应尽可能保持感染时间的一致性，以消除昼夜节律和昼夜基因调控的影响，从而降低实验重复间的变异。- 在室温（RT）下，于微量离心管中以 9,600 × g 离心 1.5 ml 菌液 2 分钟，收集菌体后弃去上清液。用 1 ml 无菌 10 mM 氯化镁（MgCl₂）溶液重悬菌体沉淀。2).
注意：镁离子可增强细胞的运动性和黏附性 P. syringae 或者，使用 MgSO₄4 在相同浓度下，无菌水可作为镁盐溶液的可接受替代品。 - 用9 ml 10 mM MgCl₂稀释菌液2 在50 ml离心管中，使用分光光度计在λ=600 nm处测定细菌的光密度（OD）。用10 mM MgCl₂稀释细菌2 至最终 OD600 nm=0.0002，用于EDS感染实验。
- 使用含有稀释后细菌溶液的1 ml无针头钝端注射器（通常称为胰岛素注射器）对叶片进行浸润。
- 不要将注射器完全装满，应注入0.5–0.6 ml液体，以便在渗透过程中实现更佳的控制。
- 将叶片下表面置于食指指尖上方，然后借助拇指轻轻调整叶片位置。将注射器垂直对准叶片表面，以确保压力均匀分布。在渗透过程中应尽量避开主脉区域，以减少叶片损伤。
- 缓慢推动注射器活塞，使菌液渗入叶片；当液体进入叶肉组织时，叶片颜色变深，可据此观察到渗透情况。应尽量浸润整个叶片表面。若单次操作无法完成全部浸润，可选择另一位置进行渗透，重复上述操作，直至覆盖整个叶片表面。
- 完成后，用吸水纸轻轻按压叶片，去除多余的病原菌溶液。目视检查感染的叶片组织是否有损伤。
注意: 浸润完成后，不应看到圆形注射器压痕。 - 将浸润处理后的植株在返回原始生长条件前干燥1-2小时。随后，用水喷洒透明罩盖，并将感染的植株覆盖2小时，然后将罩盖略微打开，形成2-3英寸的开口，并在整个感染实验的剩余时间内保持此状态。
注意：由于 P. syringae 不是一种空气传播的病原体，因此在同一设施中种植的其他植物被感染病原体传播的风险不存在。然而，作为额外的预防措施，应避免感病植株与邻近的其他实验植株发生物理接触。使用透明罩覆盖育苗盘可增强病原体的毒力并加速病害发展进程。是否需要执行此步骤以及覆盖的最佳持续时间，应根据使用者植物生长设施内的湿度条件来确定。
- 在室温（RT）下，于微量离心管中以 9,600 × g 离心 1.5 ml 菌液 2 分钟，收集菌体后弃去上清液。用 1 ml 无菌 10 mM 氯化镁（MgCl₂）溶液重悬菌体沉淀。2).
- 第5天 - 预干燥培养基平板
- 从冷藏装置中取出150 mm × 15 mm KB平板，擦干平板上已有的冷凝水。将平板置于室温下静置约24小时以彻底干燥。为加快干燥过程，可将平板盖子稍打开，置于超净工作台中30–60分钟。
注意：此步骤对于下一步中在培养板表面形成圆形液滴至关重要。
- 从冷藏装置中取出150 mm × 15 mm KB平板，擦干平板上已有的冷凝水。将平板置于室温下静置约24小时以彻底干燥。为加快干燥过程，可将平板盖子稍打开，置于超净工作台中30–60分钟。
- 第6天 - 病原体生长的定量分析
注意以下病原体定量步骤可在感染后较早的时间点进行，以确认有等量的细菌被递送至叶片中，尤其是在植物叶片形态发生改变的情况下。- 在感病基因型中，于感染组织出现黄化（表现为组织变黄）后，但在坏死病斑形成前，对感染组织进行处理。图2B).
注意建议的采样时间为病原菌接种后三天。然而，由于病原菌的生长受多种环境因素影响，孵育时间可能在2½至3½天之间有所变化，需根据用户所在植物生长设施中感染进程的仔细观察来确定具体时间。- 为每种基因型准备6个研磨管（图1）。加入一个不锈钢研磨珠，并加入500 µl无菌10 mM MgCl₂2 加入每个试管中。
- 将受感染的叶片从植株上取下，使用单孔打孔器打取一片叶盘（图1).
注意为尽量减少取样误差，建议在每片取样叶片的相同位置打孔。推荐从叶片顶部取样叶圆片。 - 使用镊子将2个叶圆片（来自两株不同的植物）随机放入每根研磨管中。
- 将管子密封，使用高通量匀浆器在最大速度（每分钟1,600次冲程）下匀浆组织10分钟。如有需要，重复此步骤，直至组织充分匀浆，且溶液因感病叶片释放叶绿素而变为绿色。
- 等待匀浆期间，向96孔培养板的前6行每孔加入180 µl 10 mM MgCl2 使用多通道移液器和移液槽。
- 研磨后，取20 µl研磨组织悬液转移至96孔板的第一排，通过反复吹打混匀。若组织碎片堵塞枪头，可剪去枪头尖端2–3 mm，以帮助准确吸取溶液。
- 为在培养板顶部为液滴提供足够的空间，应将不同基因型的组织样本交替放置在不同的行中（图1）。为制备十倍系列稀释液，将20 µl液体转移至第二行，并重复此操作直至第六个稀释梯度。
- 使用分隔的移液器吸头，将 96 孔板中的 20 µl 溶液转移至 150 mm × 15 mm KB 培养皿中（图1从最稀释的悬液开始，逐步操作至最浓的悬液。
注意从最稀释到最浓的顺序操作，可避免在稀释过程中更换移液器吸头。如果培养板预先充分干燥，转移的液滴应保持完整地停留在培养基表面，直至被吸收（通常为15–30分钟）。干燥时间因室温和湿度而异。 - 将培养皿在室温下敞盖干燥。当观察到皿表面无液体时，盖上皿盖，倒置培养皿，并在室温或28 °C培养箱中孵育。
- 将平板孵育 40–60 小时，直至菌落可见。确认平板上的菌落生长情况反映出菌落形成单位（cfu）呈可预期的 10 倍梯度下降（图2C）在细菌过度生长和菌落融合之前进行计数。确定最低稀释度下不重叠菌落数量的细菌数。通常，用于计数的理想稀释度应包含10至50个菌落。
注意技术重复之间可能存在差异，因此每个重复的最低稀释度应单独确定。 - 为计算细菌增殖水平，需书面记录行号（R）以及每个技术重复（T）中的细菌数量。通过以下公式确定每片叶圆片的菌落形成单位数：cfu/叶圆片 = （T × 10R / 20) × 500 / 2
- 在以下电子表格模板中输入数据以生成图表（图1每个数据点代表六个技术重复的均值，以对数尺度表示。误差线代表均值的95%置信区间（n = 6）。
注意：95% 置信区间的计算需根据技术重复次数进行调整。
- 在感病基因型中，于感染组织出现黄化（表现为组织变黄）后，但在坏死病斑形成前，对感染组织进行处理。图2B).
- 在无菌试管中加入含50 µg/ml抗生素的4 ml液体KB培养基，启动液体培养−1 链霉素，250 rpm、28 °C 振荡过夜。
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结果
图1. 中国台湾拟南芥植株上Psm ES4326注射浸润实验的示意图。 对生长在土壤中的成年拟南芥植株的第5和第6片叶片进行标记，并通过注射浸润法接种Psm ES4326。在出现病害症状后，取下叶片并采集叶盘用于组织匀浆。将充分匀浆的组织在96孔板中进行系列稀释，然后转移至细菌计数平板。待平板上出现菌落后，计数细菌数量，并对数据进行处理以生成图表。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MetroMix 360 | Grosouth | SNGMM360 | |
| 大号花盆 | Grosouth | TEKUVCC10TC | |
| 12 x 6 插件 | Grosouth | LM1206 | |
| 无孔 11x21 托盘 | Grosouth | LM1020 | |
| 带孔 11x21 托盘 | Grosouth | LM1020H | |
| 乙烯基扦插罩 | Grosouth | CW-221 | |
| 蛋白胨 | Fisher Scientific | DF0122-17-4 | |
| 磷酸氢二钾三水合物 | MP Biomedicals | 151946 | |
| 琼脂 | Fisher Scientific | A360-500 | |
| 硫酸链霉素 | Bio Basic Inc | SB0494 | |
| 100 x 15 mm 培养皿 | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 150 x 15 mm 培养皿 | Fisher Scientific | R80150 | |
| 矩形培养皿 | Fisher Scientific | 12-565-450 | |
| 六水合氯化镁 | Bio Basic Inc | MB0328 | |
| 甘油 | Bio Basic Inc | GB0232 | |
| 硫酸镁 | Bio Basic Inc | MN1988 | |
| 1 ml 注射器 | Fisher Scientific | NC9992493 | |
| 吸水纸（Kimwipe） | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| 研磨管 | Denville Scientific | B1257 | |
| 研磨管盖 | Denville Scientific | B1254 | |
| 不锈钢研磨珠 | Fisher Scientific | 2150 | |
| 96 孔板 | Fisher Scientific | 12-556-008 | |
| 水杨酸钠 | Sigma Aldrich | s3007-1kg | |
| flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) | Genescript | 定制合成 | |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | Genescript | 定制合成 | |
| 打孔器 | Staples | 146308 | |
| Biophotometer plus | Eppendorf | 952000006 | |
| PowerGen 高通量匀浆仪 | Fisher Scientific | 02-215-503 | |
| Accu spin 微型离心机 | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| 多通道移液器 (10-100 µl) | Eppendorf | 3122 000.043 | |
| 多通道移液器 (30-300 µl) | Eppendorf | 3122 000.060 | |
| 移液器 (20 µl) | Eppendorf | 3120 000.038 | |
| 移液器吸头 | Fisher Scientific | 3552-HR | |
| Sharpie 永久性记号笔 | Staples | 507130 | |
| 1.5 ml 离心管 | Eppendorf | 22363204 | |
| 镊子 | Fisher Scientific | 08-890 |
