评估T4噬菌体与E. coli在小鼠粪便样本中的共存情况

摘要

来源：Pett, N., et al. 小鼠肠道中T4噬菌体与E. coli的相互作用：体内研究宿主-噬菌体动态关系的典型模型。J. Vis. Exp. (2024)。

本视频展示了T4噬菌体与小鼠肠道内E. coli的体内相互作用，以及通过菌落和噬菌斑计数来量化二者共存情况的粪便斑点平板法。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 通过点样法测定粪便颗粒中T4噬菌体的浓度

1. 将每只小鼠的粪便颗粒收集到无菌、预先称重的微量离心管中，用于检测T4噬菌体和E. coli的水平。收集后立即将管子置于冰上，直至进行涂板。
   注意：在样品收集与涂板之间的间隔期间，应将样品置于冰上，以减缓耐氧细菌的生长。数小时内仍可能发生需氧细菌的增殖，或由于氧气暴露导致厌氧细菌部分死亡，从而引起细菌计数偏差。因此，应在样品采集后尽快完成细菌和噬菌体的涂板。专性厌氧细菌无法耐受氧气暴露。为保存样品，应将样品收集至密封管中，并在采集后尽快转移至厌氧培养箱中。若在粪便样品中未检测到菌落生长，可考虑采用16S rRNA定量聚合酶链式反应（qPCR）等替代方法进行细菌定量。
2. 记录每根管子的最终重量，并通过减去初始管重计算样品重量。该数值将用于将T4噬菌体和E. coli浓度标准化为每克样品中的噬菌斑形成单位（pfu/g）或菌落形成单位（cfu/g）。
3. 向每根管中加入1 mL无菌SM缓冲液（含镁盐），并在最大速度下充分涡旋振荡（>1分钟），以均质化粪便颗粒。若样品重量小于15 mg，可加入较小体积的SM缓冲液。记录每份样品所加SM缓冲液的体积，用于后续计算cfu/g或pfu/g。
4. 将每份样品取20 µL，用180 µL SM缓冲液进行连续8次（或根据预期噬菌体浓度决定是否更多）10倍系列稀释。在加入第一管/孔前，短暂涡旋振荡每份均质化样品以混匀。每次加样后使用移液器吹打混匀，并在每次稀释之间更换吸头，以防止因样品残留导致噬菌体或细菌计数偏高。
   注意：若样品中存在纤维或碎屑影响移液操作，可向粪便悬液中额外添加缓冲液，以进一步稀释原始样品。
5. 将每个稀释度的5 µL样品点样至含有E. coli的LB软琼脂平板（用于噬菌斑检测）或LB琼脂平板（含1.5%琼脂，用于细菌菌落检测），以测定每份样品中T4噬菌体和E. coli的浓度。为确保准确性，每个样品应设三个重复点样。
   注意：若在96孔板中进行系列稀释，可使用8通道P20多通道移液器将每列稀释样品转移至平板上。即使从最稀释到最浓缩方向操作，也应在每次稀释后更换吸头，因为噬菌体可能黏附于移液器吸头内壁，从而改变加入新孔中的噬菌体量。
6. 待每个点样区域完全干燥后，将平板倒置并放入培养箱中。在37 °C下过夜培养。
7. 对每份样品，选择每个点样区域中可计数噬菌斑数为3–30个的稀释度。记录该稀释度下噬菌斑的数量及所用稀释倍数。
8. 通过将噬菌斑数除以每点所点样的体积（µL），计算每微升中的pfu值（pfu/µL）。再乘以稀释倍数和每份样品所加SM缓冲液的总体积，得到每份样品的总pfu数（pfu/sample）。最后除以样品重量，得到每克样品中的pfu数（pfu/g）。

 

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Fisher BioReagents™ 琼脂，粉末/薄片，Fisher BioReagents™	Fisher Bioreagents	BP1423-500
Fisher BioReagents™ 微生物学培养基：Lennox 肉汤（粉末）	Fisher Bioreagents	BP1427-500