系统感染后小鼠脾脏和肝脏中细菌载量的定量

摘要

来源：Ahn, J. J., et al．利用单核细胞增生李斯特菌感染作为研究宿主干扰素-γ应答的模型．J. Vis. Exp. （2016）

本视频展示了对感染了胞内细菌病原体的小鼠脾脏和肝脏组织中细菌载量的测定方法。在全身性感染过程中，细菌会积聚于组织驻留的吞噬细胞内，通过去垢剂裂解和机械破碎的方法将其释放。将组织匀浆液进行系列稀释后，接种于营养琼脂平板上，经培养后通过菌落计数来反映各器官内的细菌负荷量。

方案

免责声明：所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。

1. 长期保存用甘油菌种的制备

注意：本实验方案描述了如何从单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）EGD 菌株的原始甘油保存菌种制备甘油菌种。可能产生气溶胶的步骤必须在经过认证的生物安全柜（BSC）内进行。

1. 制备用于细菌培养的脑心浸液（BHI）琼脂平板。具体步骤为：将3.8%（w/v）BHI肉汤和1.5%（w/v）琼脂加入双蒸水（ddH₂O）中₂O）。液体灭菌。当琼脂冷却至50℃时 °C，将液体分装至细菌培养皿中（每皿25 mL），并在生物安全柜中敞口干燥1小时。
   注意： 将BHI琼脂转移至50 °C水浴中，以防止倒平板前培养基凝固。将BHI平板置于4℃保存 °C 倒置（培养基面朝上）直至使用前。
2. 制备液体BHI培养基。将3.8%（w/v）BHI肉汤溶于ddH₂O中，混匀。₂O. 高压灭菌器。
3. 移除冻存的甘油菌种保藏管 单核细胞增生李斯特菌 -80℃保存的EGD菌株 °C 冷冻机中冷冻后恢复至室温。
4. 将无菌移液器吸头浸入解冻的甘油菌种中，然后立即在BHI平板的一个区域上来回划线。此为初次划线。
5. 将培养板旋转90度 °C，并使用新的移液器吸头，穿过第一区划线并将其涂布至下一区域 ¼ 平板的该区域（此为二次划线）。再重复一次，进行三次划线。
6. 将培养皿倒置，在37℃下孵育 °C过夜培养。在最后一次划线区域应获得单个均匀的菌落，且菌落可在16至24小时内可见。
7. 将10 mL无菌BHI肉汤加入无菌带通气盖的50 mL离心管中。挑取单个菌落 L. monocytogenes 使用无菌移液器吸头从平板上取菌，接种至液体培养基中。将培养物置于37℃培养 °C轨道摇床孵育过夜或直至OD₆₀₀ = 1.0，设置为每分钟225转（rpm）。
   注意： 玻璃或一次性塑料锥形瓶也可用于培养细菌。无论使用何种容器，均须确保其无菌、通气，且培养液体积不超过容器总容积的20%，以保证细菌获得充分的通气。
8. 通过将无菌的100%甘油与过夜培养的细菌液体培养物按1:1比例混合，制备甘油保存菌种。将细菌/甘油混合物分装至2 mL冻存管中（每管500 μL） µL/瓶）并将瓶转移至 -80 °C 冷冻机用于储存。
   注意： 珠菌保存法也可用于替代甘油保存法来储存细菌。该方法将多孔微珠接种于纯培养物中 单核细胞增生李斯特菌 并储存在 -80 °C. 每颗珠子可根据需要用于接种新鲜培养物。更多信息请参见材料列表。

2. 生长曲线的测定 L. monocytogenes 在日培养

注意：本实验方案描述了如何生成用于估算感染研究中单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）菌落形成单位（CFU）的生长曲线。所有可能产生气溶胶的步骤均应在经过认证的生物安全柜（BSC）内进行。

1. 取100 µ将步骤1.7中制备的过夜培养物1 mL接种于装有10 mL BHI培养基的带通气盖50 mL离心管中，在37℃下培养 °C，在摇床培养箱中（225 rpm，倾斜45°）° 角度）。使用未接种的试管作为对照。
2. 每隔一小时（1、2、3、4、5、6 小时）取 0.5 mL 培养液样品， 等等.). 在塑料比色皿中，用BHI培养基将每份等分试样按1:1（v/v）稀释。用移液器吹打混匀。在600 nm处测定光密度（OD）（OD₆₀₀) 使用分光光度计测定。继续培养细菌直至 OD₆₀₀=1.
3. 同时，取一个100 µ取100 μL培养液样品，加入900 μL稀释液 µL BHI 培养基加入无菌的 1.5 mL 微量离心管中（此为 10⁻¹ 稀释度）^-1 稀释）。在6,000 × g离心5分钟，吸除上清液。
4. 将菌体沉淀重悬于1 mL BHI培养基中，洗涤两次：每次以6,000 × g离心5分钟，随后吸弃上清液。将最终沉淀重悬于1 mL BHI培养基中。用BHI培养基对该样品进行10倍系列稀释（10^-2 至 10^-9）。加入100 µ每种稀释液取适量分别接种于独立的BHI琼脂平板上。37℃过夜培养。 °在培养箱中于 C 条件下培养。
5. 第二天，挑选菌落数在30 - 300之间的平板，其余弃去。计数这些平板上的菌落。 表1 显示了在 OD 测定时取样等分试样中获得的计数示例₆₀₀ = 0.84。在此示例中，其中一个培养皿（即， 10^-6 稀释度）的菌落数在30 - 300之间，用于CFU/mL的计算。
   注意： 菌落数超过300的平板不予使用，因为过度拥挤会抑制细菌生长，并且难以区分和计数单个菌落。菌落数量在计数范围内的平板 < 30 也不使用，因为稀释技术中的微小误差或污染物的存在可能对低浓度范围内的计数精度产生较大影响。
6. 将菌落数除以涂布体积，再乘以稀释倍数，得到特定稀释度下的CFU/mL值。在以下示例中 表1，10 的计数值^-6 稀释倍数为70。将该数值除以0.1 mL，得到稀释后培养物的CFU/mL值，再将此数值乘以稀释倍数（10⁶) 以获得未稀释培养物的CFU/mL值（7.0 x 10⁸).
7. 绘制 OD 值₆₀₀ （纵轴）相对于时间（横轴，单位为 h）绘制，以确定生长的对数期。
   注意： 该生长曲线可用于估算特定OD读数下培养液的CFU/mL值。选择一个OD₆₀₀ 处于对数生长期、可作为目标 OD 的读数₆₀₀ 用于培养日龄培养物。这些数据现在可用于估算培养物中的菌落形成单位（CFU），以制备接种物（步骤3）。

表1：显示了测定日培养物等分试样中菌落形成单位（CFU）的一些代表性计算。 在本示例中，取日培养物的一份等分试样，并以1:1比例用BHI培养基稀释。测得该稀释样品的OD₆₀₀为0.84。此外，另取100 µL等分试样用于CFU测定。该样品加入900 µL BHI培养基进行稀释（10^-1），经洗涤后重悬于1 mL BHI中。对该样品制备10倍系列稀释液（10^-2至10^-9），并将稀释后的样品接种于BHI琼脂平板上（仅显示10^-4至10^-9的结果）。次日计数菌落。仅选择菌落数在30–300之间的平板用于计算（i.e.，10^-6稀释度的平板，以黄色高亮显示）。该平板上的菌落数（70）除以接种体积（0.1 mL）得到稀释样品的CFU/mL。再将该数值乘以稀释倍数（10⁶），获得未稀释培养物的CFU/mL读数。TMTC = 菌落过多无法计数。

3. 实验感染用接种物的制备 单核细胞增生李斯特菌

注意：本步骤描述了从过夜培养物（按步骤2制备）接种并培养一天的培养物中制备感染性接种物的过程。除非另有说明，所有这些步骤均须在生物安全柜中进行。

1. 根据小鼠数量和研究的实验设计，计算感染所需的菌落形成单位（CFU）数量。向无菌通气锥形瓶或培养管中加入适量体积的脑心浸出液培养基（BHI）。
   注意：所制备细菌的CFU数量取决于实验类型。若需测定细菌载量，每只小鼠接种 2 × 10⁴ CFU 的细菌。
2. 向含有BHI培养基的培养管中接种100 µL过夜培养物。将培养物置于37 °C振荡培养箱（225 rpm）中孵育，直至达到目标OD₆₀₀值。将培养物转移至无菌离心管中。
3. 使用离心机在6,000 × g 条件下离心5分钟，使细菌沉淀。使用连接含漂白剂捕集瓶的真空装置吸除上清液。
4. 用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤沉淀物两次，每次洗涤之间以6,000 × g 离心5分钟。
5. 吸除第二次洗涤液，并将细菌用1× PBS稀释至适当浓度，使每只小鼠接种体积为200 µL，达到目标CFU。
   注意：建议使用商用无菌1× PBS进行细菌洗涤和接种液配制，因为实验室玻璃器皿可能引入脂多糖等免疫原性污染物。

4. 小鼠的实验性感染 单核细胞增生李斯特菌

注意：本实验步骤描述了如何使用步骤3中制备的接种物感染小鼠，以及如何验证接种物中递送的菌落形成单位（CFU）。小鼠的操作和注射均在生物安全柜（BSC）中进行。

1. 为实验订购足够数量的雄性或雌性 C57BL/6J 小鼠，并另订购用于未感染对照组的小鼠。
2. 在细菌接种前，让小鼠适应环境 1 周。
   注意：这是由于运输动物带来的应激可引发应激激素短暂升高以及淋巴细胞减少。
3. 接种当天，测量每只小鼠的基础体重，并记录在实验记录本中。
4. 在生物安全柜中，使用无菌移液器反复吹打细菌悬液，确保细菌均匀分布，然后用配有 25 G 针头的 1 mL 安全型注射器吸取 200 µL 接种物。
5. 通过腹腔注射（i.p.）方式向小鼠注射 200 µL 制备好的接种物。操作时，用非优势手抓住小鼠肩部附近的松弛皮肤固定小鼠。确认小鼠被充分固定后，在腹部下象限、靠近腹中线外侧的位置进针，以避开膀胱。
6. 将针头和注射器丢弃至生物危害锐器容器中。
7. 重复步骤 4.3 至 4.6，直至所有小鼠完成注射。对使用 1x PBS 注射的小鼠（非感染对照组）执行类似操作。
   注意：由于菌落形成单位（CFU）是基于生长曲线的估算值，因此最好检测接种物中的实际 CFU。为此，将制备好的接种物进行 3–4 个不同梯度的稀释（采用 10 倍系列稀释），选择预期能产生可计数菌落的稀释度。取每种稀释液 100 µL 涂布于 BHI 琼脂平板，37 °C 过夜培养。计数菌落后，按照实验步骤 2 中所述方法计算实际的 CFU/mL。

5. 在感染高峰期测量脾脏和肝脏中的细菌载量

注意：所有步骤均应在生物安全柜内进行，除非另有说明。

1. 腹腔注射 2 x 10⁴ 使用第4步中所述程序测定病原体的菌落形成单位（CFU）。
2. 感染后第3天，准备无菌的1.5 mL微量离心管，每管含有500 µL 冰冷的无菌 0.1% Triton X-100 溶液（溶于 1x PBS）和 0.2–0.3 g 酸洗无菌玻璃珠（直径 1.5–2 mm）。称量每支试管。
   注意： 玻璃珠在烧杯中用磁力搅拌器孵育于10%乙酸中1小时进行酸洗。随后用ddH₂O彻底洗涤这些珠子。₂O以去除酸，晾干后，在使用前进行高压灭菌。
3. 通过 CO 处死小鼠₂ 暴露
4. 器官解剖时，将动物仰卧位置于解剖板上，用25 G针头固定小鼠四肢。用70%乙醇润湿皮肤以消毒。
5. 使用无菌的硬质剪刀，从腹股沟至胸部中线处沿正中线剪开皮肤，再从腹股沟中点分别向两侧膝盖方向、从胸部中点分别向两侧肘部方向剪开。钝性分离并翻折皮肤，用25 G针头将其固定张开。
6. 用70%乙醇润湿肌层进行消毒，然后使用无菌精细剪刀在腹膜壁上做正中切口。用镊子夹住剑突，再用同一把精细剪刀从剑突处沿两侧肋骨下缘、紧贴膈肌下方，向侧方剪开腹膜壁，以暴露肝脏。
7. 使用无菌剪刀切取约100 mg的肝脏组织（所有小鼠均取自同一肝叶），置于已预称重的1.5 mL微量离心管中。
8. 用镊子轻轻拨开腹腔左侧的器官以暴露脾脏。用一对镊子轻轻夹住脾脏，切断其周围结缔组织，将脾脏从腹腔中分离。
9. 将脾脏放入已预称重的含有珠子的1.5 mL微量离心管中。将组织置于含冰的防漏容器中运送至实验室。重新称量含有器官的离心管，以确定组织重量（单位：mg）。
10. 使用珠磨匀浆器以每分钟30赫兹的频率振荡离心管3分钟，使组织充分匀浆。
    注意： 珠磨法是首选的均质化方法，因其适用于处理大量样本，且产生的污染较少，可降低接触病原体的风险。然而，也可使用自动匀浆器或经高压灭菌的2 mL手动玻璃组织匀浆器作为替代方案。
11. 在含0.1% Triton-X-100的1x PBS中制备匀浆液的10倍系列稀释液，稀释梯度从原液（未稀释）至10⁻⁶^-7).
12. 铺板100 µ将每种稀释后的匀浆液各 L 用无菌涂布棒接种至 BHI 琼脂平板（设两个重复）。将平板转移至 37 °C 培养箱中过夜培养。
13. 保留每个平板上菌落数在30至300之间的平板，其余弃去。计数每个平板上的菌落，并计算平行涂布组的平均菌落数。
14. 根据以下公式计算每毫克菌落形成单位（CFU/mg）：CFU/mg = 匀浆液中的CFU/mL × 制备的匀浆液体积（mL）÷ 匀浆组织重量（mg）。
    注意： 例如，在涂布100个样本后，计数得到平均30个菌落 µ10 升^-2 由120 mg肝脏组织在0.5 mL缓冲液中匀浆后制备的稀释匀浆液进行计算，方法如下： CFU/mL = 30个菌落 × 100（稀释倍数）/ 0.1 mL（涂布体积）= 30,000 CFU/mL。 CFU/mg = 30,000 CFU/mL × 0.5 mL匀浆液体积 / 120 mg组织 = 125 CFU/mg。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
改良脑心浸液肉汤	BD	299070	任何品牌均可适用
琼脂	BD	214010	任何品牌均可适用
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	任何品牌均可适用
1x PBS	Sigma	D8537	任何品牌均可适用
TissueLyser II	Qiagen	85300	任何品牌均可适用
16% 多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	15710	用ddH2O或1x PBS稀释至4% PFA
10x 穿透/洗涤缓冲液	BD	554723	用ddH2O稀释至1x
OneComp eBeads	eBioscience	01-1111	每种染色使用一滴
50 ml 通气培养管			用于细菌培养，任何品牌均可适用
1.5 ml 微量离心管			任何品牌均可适用
细菌培养用培养皿			任何品牌均可适用
2 ml 冻存管			任何品牌均可适用
紫外分光光度计			任何品牌均可适用
安全型针头			任何品牌均可适用
C57BL/6J	Jackson laboratories	Stock#000664	订购时要求到达时间为7周龄
70% 乙醇			用于去污染
玻璃珠			任何品牌均可适用
离心机			转子、吊桶、吊桶盖
微量离心机			任何品牌均可适用
无菌甘油			任何品牌均可适用
移液器吸头			任何品牌均可适用
移液器			任何品牌均可适用
手术器械			任何品牌均可适用
3 ml 注射器			任何品牌均可适用
过滤装置			任何品牌均可适用
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