小鼠脾细胞体外热灭活刺激 单核细胞增生李斯特菌

摘要

来源：Ahn, J. J., 等 ，利用Listeria monocytogenes实验性感染作为研究宿主干扰素-γ应答的模型。J. Vis. Exp. (2016)

本视频演示了从感染单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的小鼠中制备脾细胞培养物，用于后续的细胞因子分析。内容包括体外细菌来源抗原刺激及样品处理，以研究T细胞免疫应答。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 作用 单核细胞增生李斯特菌 IFN-γ反应中的CD4⁺ 和 CD8⁺ 细胞

注意：本实验方案描述了如何通过两种方法测量适应性免疫反应高峰期（感染后约 7 天）所收获的脾脏 CD4⁺ 和 CD8⁺ 效应 T 细胞产生 IFN-γ 的水平：（1）通过胞内细胞因子染色结合流式细胞术检测 CD4⁺ 和 CD8⁺ 细胞中的 IFN-γ（干扰素-γ）表达；（2）通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测脾细胞（包含所有 T 细胞）产生的总 IFN-γ 水平。所有操作均在生物安全柜（BSC）内进行。

1. 按照步骤4中所述方法，通过腹腔注射2 × 10⁴ 菌落形成单位（CFU）的病原体感染小鼠。
2. 感染后第7天，根据机构指南，采用CO₂吸入法对小鼠实施安乐死。
3. 解剖脾脏并将其置于含有无菌1×PBS（磷酸盐缓冲液）的15 ml锥形管中。将管子放入含冰的防漏容器中，运送至实验室。
4. 将脾脏组织处理成单细胞悬液，按第6节所述方法裂解红细胞，然后将细胞重悬于含10%胎牛血清（FCS）的完全RPMI（Roswell Park Memorial Institute）培养基中。使用血细胞计数板进行细胞计数。
5. 建立用于检测IFN-γ反应的细胞培养体系。将细胞（每孔4 × 10⁶个，体积1 ml）加入24孔板中，并加入等量（4 × 10⁶个或1 ml/孔）解冻后的热灭活L. monocytogenes。将细胞转移至37 °C培养箱中孵育。
6. 孵育20小时后，向每孔加入0.66 μl/ml蛋白转运抑制剂，继续孵育。
7. 4小时后，将培养板转移至生物安全柜（BSC），收集500 µl培养上清液，于-80 °C冷冻保存，用于后续使用商用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒检测IFN-γ水平。随后，将细胞收集至无菌15 ml离心管中。用1×PBS洗涤各孔，并将洗涤液与收集的细胞合并。
8. 对CD4⁺和CD8⁺细胞进行细胞表面染色及IFN-γ胞内染色。进行流式细胞仪检测（每样本采集200,000个事件），并使用流式细胞分析软件分析数据。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
改良脑心浸液肉汤	BD	299070	任何品牌均可适用
1x PBS	Sigma	D8537	任何品牌均可适用
RPMI 1640	Gibco	22400089	任何品牌均可适用
胎牛血清	Gibco	12483	使用前于56 °C加热灭活30分钟
高尔基体阻断蛋白转运抑制剂（含莫能菌素）	BD	554724	在6 ml细胞培养液中使用4 μl
10x 穿透/洗涤缓冲液	BD	554723	用ddH2O稀释至1x
50 ml 通气培养管			用于细菌培养，任何品牌均可适用
1.5 ml 微量离心管			任何品牌均可适用
细菌培养用培养皿			任何品牌均可适用
C57BL/6J 小鼠	Jackson laboratories	Stock#000664	订购时安排在7周龄时到达
漂白剂			用于去污消毒
70% 乙醇			用于去污消毒
移液器吸头			任何品牌均可适用
移液器			任何品牌均可适用
移液枪			任何品牌均可适用
圆底培养板			任何品牌均可适用