利用阿米巴作为宿主系统检测细菌毒力

摘要

来源：Dubois, V., et al。用于吞噬细胞内复制的Mycobacterium abscessus毒力标志物的鉴定。J. Vis. Exp. (2018)

本视频演示了将阿米巴与突变细菌菌株共培养的实验步骤，通过菌落计数的差异来评估细菌的胞内存活能力，并鉴定毒力标志物。

方案

1. 阿米巴-共培养脓肿分枝杆菌 Tn突变体：初筛
   注意这需要3–4个月来筛选6,000个突变体。
   1. 铺板 5 × 10⁴ 变形虫Acanthamoeba castellanii/孔，加入96孔板，每孔100 µL ACAcanthamoeba castellanii) 缓冲液中。在32 °C下孵育1小时，不振荡。让悬浮的阿米巴滋养体有足够时间贴附于孔壁。孵育期间，将细菌置于冰上解冻1小时。
   2. 使用电子多通道移液器加入5 µL解冻的细菌培养物。感染1.5小时。从96孔板转座子突变体文库中筛选约6,000个独立克隆。
      注意：在此实验步骤中，感染复数（MOI）未知；然而，所有含有转座子突变株的96孔板均以完全相同的方式进行培养。该初筛的目的是快速鉴定出胞内缺陷型突变株，而不考虑接种菌液密度的差异。
   3. 感染1.5小时后，在生物安全柜中将96孔板倒置于灭菌金属托盘内的无菌纱布上，以去除AC培养基。随后每孔重新加入200 µL AC培养基。重复此洗涤步骤两次。
   4. 加入200 µL新鲜培养基，其中添加100 µg/mL阿米卡星，以清除残留的胞外分枝杆菌。
   5. 孵育2小时后，再进行3次额外洗涤。洗涤后，用含有50 µg/mL阿米卡星的200 µL AC缓冲液维持培养。
   6. 加入 5 x 10⁷ 在感染结束时及此后每24小时加入热灭活的大肠杆菌，以防止阿米巴原虫包囊化。
   7. 共培养48小时后，每孔加入10 µL 10% SDS（十二烷基硫酸钠），在32 °C下孵育30分钟以裂解细胞。随后进行系列稀释，并接种至含5%羊血的哥伦比亚琼脂平板（COS平板），以评估胞内分枝杆菌数量。用封口膜密封平板，在37 °C下孵育。
   8. 当培养3-4天后琼脂平板上出现菌落时，拍摄平板照片，并通过观察细菌菌落数量最少的沉积区域，鉴定出胞内生长缺陷的突变株。
      注意：无需关注菌落的形状、高度或密度（图1A鉴定出136/6000个突变体。

结果

图1：A. 初次视觉筛选 M. abscessus Tn 阿米巴中的突变体 (A大规模筛选 Tn 在96孔板中以随机感染复数对阿米巴进行突变株感染，以快速鉴定减毒突变株。B减毒株的鉴定 Tn 突变体破坏了基因。 T...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔板	Thermofisher	11874235
96孔板	Thermofisher	10687551
Qubit荧光仪	Thermofisher	Q33226
Acanthamoeba castellanii	ATCC	30010	菌株
阿米卡星	Mylan	150927-A	粉末
CaCl2	Sigma-Aldrich	C1016	>93% 颗粒状无水
哥伦比亚琼脂	Biomerieux	43041	90 mm
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270	粉末
DMEM	Thermofisher	11500596	培养基
无DNase和RNase的水	Invitrogen	10977-035	溶液
Escherichia coli	临床分离株	自存菌种	细菌
胎牛血清	Gibco	10270	血清
穆勒-欣顿琼脂	Biorad	3563901	粉末
20% SDS	Biorad	1610418	溶液