细胞内复制检测实验 志贺氏菌 在人结肠上皮细胞中

摘要

来源：Poore, K., 等. 利用志贺氏菌进行上皮细胞感染分析。视频实验杂志（2024）

本视频展示了一种用于评估的体外实验方法 志贺氏菌 在人结肠上皮单层细胞中进行侵袭与胞内复制。该方法强调了感染、抗生素筛选、宿主细胞裂解以及胞内细菌回收以用于后续分析的关键步骤。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 胞内复制实验

注意：所有体积均基于使用两块6孔板的实验设计。

1. 过夜传代培养 志贺氏菌 培养物 通过 1:50 稀释至新鲜培养基中。
   1. 涡旋混匀，然后将每种过夜培养物各100 µL加入到合适大小的培养管中，分别含有5 mL新鲜TSB（胰蛋白胨大豆肉汤）或TSB + BS（胆盐）。
      注意： 限制培养体积 <培养瓶或试管体积的20%，以确保适当的通气。
   2. 在37 °C、250 rpm振荡培养，直至细胞达到设定的OD值₆₀₀ （光密度）为0.7（对数生长中期） 志贺氏菌 生长）；约2-2.5小时。
      注意： 传代过程中，分装50 mL DMEM加50 mg/mL庆大霉素，以及足量的磷酸盐缓冲液（PBS），用于所有洗涤步骤，并置于37 °C水浴中。使用前确保培养基温度升至37 °C。
2. 转移 2 x 10⁸ 菌落形成单位（CFUs）的继代培养 志贺氏菌 至各自的 2 mL 微量离心管中。
   注意： 2 x 10⁸ 菌落形成单位（CFUs）对应于光密度（OD）为一定值时约1 mL的细菌细胞₆₀₀ 0.7。使用OD₆₀₀ 根据每台分光光度计的校准情况，将读数换算为近似的CFU/mL。
3. 洗涤 志贺氏菌 用 PBS 洗涤样本 1 次。
   1. 通过离心沉淀细胞，离心条件为 17,000 x g 室温孵育2分钟。吸除上清液，加入1 mL预热的PBS，充分重悬沉淀，轻轻吹打样品8–10次，直至混合液完全均匀。
   2. 再重复洗涤步骤一次。
   3. 通过离心沉淀细胞，离心条件为 17,000 x g 室温孵育2分钟，吸除上清液，将沉淀重悬于2 mL预热的DMEM中。
      注意： 重悬细菌的最终浓度为 1 x 10⁸ CFU/mL
4. 涡旋，然后加入 1 mL（1 x 10⁸ 重悬的菌落形成单位（CFUs） 志贺氏菌 向6孔板中已准备好的HT-29结肠上皮单层细胞的每孔加入1 mL DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）。
   注意： 感染通常在感染复数（MOI；细菌与上皮细胞的比例）为100的条件下进行。若需测试不同MOI，可将重悬的 志贺氏菌 在DMEM中将细菌稀释至所需浓度，然后向HT-29单层细胞中加入1 mL稀释后的细菌。例如，若要检测MOI为10的条件，可通过加入150 µL的1 × 10⁸ 将CFU/mL细菌加入1.35 mL DMEM中，然后加入1 mL（1 × 10⁷ 菌落形成单位（CFUs）与HT-29细胞的共培养。
5. 为促进细菌与HT-29细胞的接触，将6孔板在2,000 x g 室温或可调节温度至37 °C下孵育10分钟。
   注意： 离心作用促进细菌与HT-29细胞的接触，从而绕过对黏附因子的需求，使细菌能够快速侵入细胞。
6. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育6孔板₂ 45 分钟。
7. 孵育期间，测定细菌感染滴度。
   1. 制备重悬液的10倍系列稀释液 志贺氏菌 细胞加入PBS中。
   2. 加入100 µL的1 x 10⁶细胞/毫升悬液至培养板中^-5 和 1 × 10^-6 在TSB + 刚果红平板上进行稀释涂布，并于37 °C过夜培养。
      注意： 从1 x 10稀释液中接种100 µL^-5 和 1 × 10^-6 稀释对应于1 x 10的最终稀释倍数^-6 和 1 × 10^-7分别。
8. 用 1 mL PBS 彻底清洗感染的 HT-29 细胞 3 次。
   1. 吸出每孔中的培养基。
      注意： 从6孔板中吸取培养基时，应将移液器吸头沿孔底部引导，尽量避免接触HT-29细胞。
   2. 每孔加入 1 mL 温和的 PBS，轻轻洗涤。
      注意： 轻轻用 PBS 洗涤 6 孔板中的单层细胞时，应在实验台面上上下、左右移动培养板。以圆形轨迹洗涤或从实验台面取下培养板可能导致细胞从塑料表面因机械作用而脱落。
   3. 重复洗涤步骤两次。
9. 吸除 PBS，每孔加入 2 mL 含 50 µg/mL 庆大霉素的预热 DMEM，于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 30 分钟₂.
10. 用 1 mL PBS 将感染的 HT-29 细胞彻底洗涤 3 次。
    1. 重复步骤1.8的洗涤操作。
11. 吸除 PBS，随后向 6 孔板的每孔中加入 2 mL 含 50 µg/mL 庆大霉素的预热 DMEM，于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育₂ 在所需时间内孵育，以允许细胞内复制（最长24小时）。
12. 用 1 mL PBS 将细胞彻底洗涤 2 次。
    1. 重复步骤 1.8 的洗涤操作。
13. 吸除 PBS，每孔加入 1 mL PBS + 1% Triton X-100 裂解 HT-29 细胞。
14. 将6孔板在37 °C孵育5分钟。
15. 使用细胞刮棒或弯头移液器吸头将裂解的细胞从孔底刮下，并将全部1 mL液体转移至新的1.7 mL微量离心管中。
16. 确定细胞内细菌数量。
    1. 涡旋振荡每个试管（来自步骤 6.15）至少 30 秒，以进一步混匀 志贺氏菌 来自裂解的真核细胞。
    2. 将裂解液用PBS进行10倍系列稀释。
    3. 接种100 µL的1 x 10⁶细胞/mL细胞悬液^-2，1 × 10^-3，以及 1 × 10^-4 在TSB + 考马斯亮蓝平板上进行梯度稀释，并于37 °C过夜培养。
       注意： 从1 x 10稀释液中接种100 µL^-2，1 × 10^-3，以及 1 × 10^-4 稀释对应于最终稀释倍数为 1 x 10^-3，1 × 10^-4，以及 1 × 10^-5分别。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
14 mL 培养管	Corning	352059	17 mm x 100 mm 聚丙烯带盖试管
50 mL 锥形离心管	Corning	430829	50 mL 透明聚丙烯圆锥底离心管，带防漏盖
6 孔组织培养板	Corning	3516	经表面处理，利于细胞最佳贴附
胆盐	Sigma-Aldrich	B8756	胆酸与脱氧胆酸按 1:1 比例混合
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco	10569-010	DMEM 添加高糖、丙酮酸钠、GlutaMAX 和酚红
胎牛血清（FBS）	Sigma-Aldrich	F4135	经热灭活，无菌
庆大霉素	Sigma-Aldrich	G3632	储存浓度为 50 mg/mL
HT-29 细胞系	ATCC	HTB-38	腺癌细胞系，来源于结直肠
磷酸盐缓冲液（PBS）	Thermo Fisher Scientific	10010049	1x 浓度；pH 7.4
T75 培养瓶	Corning	430641U	组织培养瓶
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	一种常见的非离子型表面活性剂和乳化剂
胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200-056	用于细胞解离，以维持和传代细胞系
胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）	Sigma-Aldrich	T8907	细菌生长培养基