使用流式细胞术分析巨噬细胞受体与致病菌的相互作用

摘要

来源： Barbero, A. M., 等荧光检测法在研究中的应用 结核分枝杆菌 与免疫受体SLAMF1的相互作用。 J. Vis. Exp. (2025)

本视频演示了标记可结合细菌表面抗原的宿主免疫受体的实验步骤，从而通过流式细胞术对其进行检测。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

Mycobacterium tuberculosis通过流式细胞术检测SLAMF1（信号淋巴细胞激活分子1）相互作用

1. 蛋白质-细菌交联
   1. 将1 × 10⁶个完整灭活的Mycobacterium tuberculosis细胞（WCMtb，经γ射线灭活的M. tuberculosis）与来自1 × 10⁶个巨噬细胞的蛋白提取物（50 µL）在4 °C下于旋转微量离心管架中孵育过夜。
      注意：10 µL WCMtb = 1 × 10⁶个细菌，通过分光光度计在600 nm处测定光密度（O.D.）进行定量，O.D.值为1时相当于1 × 10⁸个细菌/mL。
   2. 次日，加入500 µL用1× PBS（磷酸盐缓冲盐水）稀释的1%甲醛溶液，在室温（RT）下振荡孵育15分钟。
   3. 加入25 µL用水稀释的0.125 M甘氨酸溶液，在室温下振荡孵育5分钟。
   4. 用1 mL 1× PBS在14,000 × g离心5分钟，洗涤两次。每次洗涤后弃去上清液。
   5. 重悬沉淀，并将悬液加入500 µL交联剂乙二醇双（琥珀酰亚胺基琥珀酸酯）（EGS，2 mM）中，该交联剂溶于冰醋酸:水（1:1）混合液中，在室温下孵育1小时。
      注意：建议在使用前现配试剂。配制EGS溶液时，需将冰醋酸和水等比例混合并加热至70 °C。若溶液温度不足，EGS将无法完全溶解。
2. SLAMF1染色
   1. 重复步骤1.1.4，第一次洗涤使用500 µL 1× PBS，第二次使用1 mL。
   2. 向微量离心管中加入抗人SLAMF1抗体，涡旋混匀，在4 °C避光条件下孵育30分钟，以标记蛋白质-细菌复合物。抗体用量应适用于1 × 10⁶个细胞（2.5 µL或0.125 µg）。
   3. 使用FACS（荧光激活细胞分选）洗涤细胞以去除未结合的抗体，将沉淀重悬于FACS缓冲液中，并在流式细胞仪上检测样品。
      注意：需进行相应的同型对照或FMO（荧光减一）对照

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 488 二抗	Invitrogen	A21121	用于荧光显微镜检测
抗 SLAMF1 FITC 抗体	eBioscience	11-1509-42	用于流式细胞术
抗 SLAMF1 PE 抗体	BioLegend	306308	用于流式细胞术
抗 SLAMF1 一抗	BioLegend	306302	用于荧光显微镜检测
Aqua-Poly/Mount	Polysciences	18606-20	封片剂
CD14 MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-097-052	用于单核细胞分离
12 mm 盖玻片	HDA	-	用于显微镜下的相互作用检测
EGS	ThermoFisher Scientific	21565	用于交联处理
FACSCanto II	BD Biosciences	338960	配备 BD FACSDiva 软件的流式细胞仪
胎牛血清	Natocor	-	灭活并经γ射线辐照，用于巨噬细胞培养
Ficoll-Paque PLUS	Cytiva	17144003	用于外周血单个核细胞（PBMC）分离
Fiji/ImageJ	开源软件	-	用于显微图像分析
FlowJo 7.6.2	Tree Star	-	用于流式细胞术数据分析
甲醛	Merck	K47740803613	用于交联处理
载玻片	Glass Klass	-	用于显微镜下的相互作用检测
甘氨酸	Sigma	G8898	用于交联处理
M. tuberculosis H37Rv 菌株，γ射线辐照全菌体	BEI Resources, NIAID, NIH	NR-14819	用于相互作用检测
M. tuberculosis H37Rv 菌株，全细胞裂解物	BEI Resources, NIAID, NIH	NR-14822	用于巨噬细胞刺激及相互作用检测
Neofuge 13R	Heal Force	Neofuge 13R	用于蛋白质提取的高速冷冻离心机
青霉素/链霉素	Gibco	15140122	用于巨噬细胞培养
PMSF	ThermoFisher Scientific	36978	用于蛋白质分离
聚-D-赖氨酸	Sigma Aldrich	A-003-M	用于盖玻片处理
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma Aldrich	P8340	用于蛋白质分离
RPMI 1640	Gibco	11875093	用于巨噬细胞培养
Sorvall ST 16/16R 离心机	ThermoFisher Scientific	75004240	用于外周血单个核细胞（PBMC）和单核细胞分离