一种用于研究人类口腔生物膜与上皮相互作用的Transwell组织模型

摘要

来源：Alshehri, M. et. al., 用于体外研究宿主-病原体相互作用的类器官组织模型系统 In Vitro。J. Vis. Exp. (2025)

本视频展示了一种利用多物种口腔生物膜与人类口腔上皮组织的共培养模型。该模型可揭示上皮免疫激活过程，并支持宿主-病原体相互作用的下游分析。

方案

以下实验方案涉及制备一种代表牙龈炎的多物种生物膜，共包含7个物种（spp.）。其中包含三种链球菌属（Streptococcus）物种：Streptococcus mitis（NCTC 12261）、Streptococcus intermedius（DSM 20753）和Streptococcus oralis（NTCC 11427），用于模拟口腔健康状态，作为唾液薄膜的初始定植菌。随后加入四种与口腔健康向疾病转变相关的厌氧微生物：Veillonella dispar（NCTC 11831）、Actinomyces naeslundii（DSM 17233），以及两种梭杆菌属（Fusobacterium）物种：Fusobacterium nucleatum（ATCC 10953）和Fusobacterium nucleatum亚种（subspp.）vincentii（DSM 19507）。所有操作步骤均在火焰旁或II级生物安全柜中无菌进行。用于微生物制备的所有培养基和磷酸盐缓冲液（PBS）在使用前均经高压灭菌，并在实验过程中定期检测无菌状态。本研究中所用试剂与设备的详细信息见材料表。

1. 共培养微生物群落的制备

注意：本方案描述了一种多物种生物膜的构建方法，该生物膜代表了与牙龈组织炎症（即牙龈炎）相关的微生物群落。

1. 从保存在-80°C的多孔珠冻存管（商业获取）中复苏三种链球菌，使用接种环采用划线法将菌种接种于血琼脂平板（含5%无菌脱纤维马血的哥伦比亚血琼脂基础培养基）进行复苏。
   1. 37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时₂，然后挑取3-4个菌落接种于10 mL胰蛋白胨大豆肉汤培养基中进行扩增培养。在37 °C、5% CO₂条件下培养16-18小时。₂.
2. 对于中等致病性病原体，复苏 V. dispar，A. naeslundii，F. nucleatum 和 F. nucleatum 亚种 vincentii 在37 °C下于含5%无菌去纤维马血的专性厌氧琼脂培养基中厌氧培养48小时，随后在相同条件下于Schaedler肉汤中继续培养24-48小时。
3. 生长后，于20 °C、3000 x g离心5 min，使细胞悬浮液沉淀，随后用10 mL无菌PBS（pH 7.2–7.6）洗涤沉淀。再次于20 °C、3000 x g离心5 min，使细胞沉淀，重复洗涤步骤一次。将洗涤后的细胞重悬于10 mL无菌PBS中，用于标准化。
4. 使用分光光度计在550 nm处分别对三种链球菌（Streptococcus spp.）进行标准化。吸光度值为0.50（可接受范围为0.45–0.55）时，表明细胞浓度约为1 × 10⁸ CFU/mL⁸ 细胞/mL，该数值系先前采用Miles和Misra细胞计数法测定所得。为达到此吸光度值，需将10 mL洗涤后的细胞悬液用无菌PBS进一步稀释。
5. 标准化后，将所有链球菌属（Streptococcus spp.）稀释1:10，至1 × 10⁷ 细胞/mL，加入到含有13 mm直径羟基磷灰石圆片的24孔微量培养板中，每孔500 μL，使用移液器操作。将生物膜在37 °C、5% CO₂条件下培养24小时使其成熟₂.
   注意： 多物种生物膜可在多种与口腔相关的基质表面培养，例如釉质、牙本质以及聚甲基丙烯酸甲酯义齿表面。这些模型亦可使用其他培养基，如人工唾液或合成唾液，但需根据所用微生物群落的组成谨慎选择：已有研究表明，培养基的选择对混合菌群生物膜的生长具有重要影响。
6. 第二天，以与上述相同的方式（步骤 1.2–1.4）对四种厌氧微生物进行标准化。离心收集细胞悬液，洗涤两次，然后将 V. dispar 的悬液调整至吸光度 0.50（范围 0.45–0.55），其余三种微生物调整至吸光度 0.20（范围 0.18–0.22）。标准化后，将所有悬液进一步稀释 1:10，至 1 × 10⁷ 细胞/mL，采用等体积混合的THB和RPMI培养基
7. 小心吸去链球菌生物膜中未贴壁的细胞和废弃培养基并弃去。用500 μL标准化的1 × 10⁸ CFU/mL菌悬液替换微孔板孔中的液体⁷ 4 种厌氧菌的细胞浓度为 cells/mL 的菌悬液。在 37 °C 厌氧条件下培养生物膜 24 小时。
8. 24小时后，移除7种菌生物膜中未黏附的细胞和耗尽的培养基，加入500 µL无菌的THB与RPMI培养基1:1混合液。将生物膜在37 °C下厌氧培养4天，期间每天更换培养基（共更换四次）。
9. 第7天，多物种生物膜已完全成熟，可进行后续实验。使用500 μL无菌PBS洗涤生物膜两次，用于共培养。
   注意： 生物膜可通过多种生物学方法进行分析，例如使用qPCR（用于组成分析）以及共聚焦显微镜或电子显微镜进行显微成像分析。

2. 器官型组织处理与实验设置

注意： 下文所述的实验设置涉及由在惰性聚碳酸酯膜滤器上培养的TR146细胞组成的人口腔上皮（HOE）组织。其他模型也存在，包括表皮模型、膀胱、食管、角膜、牙龈和阴道上皮。所有模型的处理和制备方法均与下文所述类似，用于研究宿主-病原体相互作用。

1. 到货后，立即开箱并将HOE组织及培养基转移至II级生物安全柜中。向12孔板中加入共1 mL随组织提供的维持培养基。
2. 用无菌镊子从用于运输的24孔板和营养琼脂中取出含有HOE的聚碳酸酯插件，并将其转移至含培养基的12孔板中，确保组织下方无气泡残留。使用另一把镊子或滤纸小心去除附着在插件侧面或底部的多余琼脂。
3. 将组织模型在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育 24 小时_2, 在实验设置前，组织模型需在运输后适应实验室条件。值得注意的是，对于组织模型的长期维持或进一步成熟，可提供其他维持培养基或生长培养基。
4. 现在可以进行共培养实验。以本示例为例，通过超声处理将上述步骤（1.1–1.9）制备的7种物种生物膜从其基质上移除。具体操作如下：使用19 G针头和镊子将含有生物膜的羟基磷灰石（HA）圆片从24孔板底部取出，转移至含有1 mL无菌Dulbecco's PBS的bijoux管中，在超声水浴中以35 kHz频率超声处理10分钟。
5. 使用镊子小心取出过夜适应后的含组织模型的插入物，用移液器直接向组织中加入100 µL生物膜超声悬浮液。为进行比较，使用未刺激的对照组织。对于这些对照组织插入物，加入100 µL不含生物膜悬浮液的无菌杜氏磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）。
   注意： 浮游细胞、含有分散细胞的用过生物膜上清液或完整生物膜可替代生物膜超声裂解物用于共培养模型。使用不同微生物刺激物的这些宿主-病原体模型的不同应用示意图如下所示 图1 如其他文献所述。
6. 加入后，将插入物转移至另一24孔板中，每孔含1 mL新鲜维持培养基，再次确保插入物下方无气泡。将含有组织模型的培养板在37 °C、5% CO₂条件下孵育24 h。_2, 在进行后续应用的组织处理之前。
   注意： 组织供体可提供额外的培养基，以支持组织在接触超声处理的聚集体或生物膜后继续培养。为此，已有若干先前模型发表，用于研究组织与生物膜长期共培养的情况。若要在当前的类器官模型中实现类似结果，可对组织进行超声处理（如上文步骤2.6所述），并让微生物附着24小时。弃去残留的微生物悬液，并在气液界面条件下继续培养至所需的实验时间点。

3. 实验检测的组织处理

注意： 共培养后，组织模型将被处理以获取实验结果。

1. 首先，在含有1% β-巯基乙醇和约相当于100 µL的0.5 mm酸洗玻璃珠的2.0 mL螺口O型圈管中，准备350 µL RLT裂解缓冲液。
2. 用镊子将含有组织的插入物从培养基中取出，并弃去插入物中残留的微生物悬液。接着，将其倒置，置于 eye level 以便操作。使用19 G针头，小心地从插入物底部切开组织和膜，并转移至RLT缓冲液中。
   1. 使用台式珠磨匀浆器匀浆组织，时间为30 s。

结果

图1：类器官组织共培养模型的不同应用。 将标准化的微生物悬液直接施加于组织上，以研究物种与宿主之间的相互作用（A）。此类方法常用于短期（例如<24 h）内微生物定植的评估。通过超声处理复杂生物膜，以研究分散的细胞或生物膜聚集体对组织的影响（B）。这一点至关重要，因为已有研究表明，这些细胞相较于浮游状态或生物膜状态的对应细胞具有独特的表型；为此，可通过额外的小型插入装置将完整生物膜直接添加至组织，从而实现与宿主相邻的暴露（C<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
13 mm 羟基磷灰石（HA）圆片	Plasma Biotal Limited	n/a（按需定制）	模拟牙齿表面的口腔生物膜形成底物
19 G 针头（40 mm）	VWR	613-2028	用于辅助从培养板中取出HA圆盘，并从插入物中切割出组织
24孔带盖TC处理平底微孔板	科学实验室用品	3524（每包100个）	用于生物膜培养和组织共培养实验的培养板
酸洗玻璃珠（425–600 μm）	默克：西格玛奥德里奇	G8772	为提高RNA提取的得率进行组织裂解
缓症链球菌 DSM 17233	莱布尼茨学会德国微生物菌种保藏中心	n/a	用于复杂生物膜模型的一种微生物
Bead Mill 24 均质器（或同等设备）	Fisher Scientific	15-340-163	为提高RNA提取的得率进行组织裂解
Bijouxes（7 mL）	Greiner Bio-One	189170（每袋700）	用于生物膜超声处理
哥伦比亚血琼脂（CBA）基础培养基	赛默飞世尔科技	CM0331B（500克装）	用于制备培养需氧微生物的CBA平板
脱纤维马血	E&O 实验室	DHB	用于补充 CBA 和 FAA 平板，以培养需氧和厌氧微生物
杜氏磷酸盐缓冲液（dPBS：不含 CaCl₂ 和 MgCl₂）	默克：Sigma-Aldrich	DB537	用于生物膜超声破碎液与细胞共培养的 dPBS
具核梭杆菌 ATCC 10953	美国典型培养物保藏中心	n/a	用于复杂生物膜模型的一种微生物
具核梭杆菌 亚种（subspp.） vincentii DSM 19507	莱布尼茨学会DSMZ	n/a	用于复杂生物膜模型的一种微生物
GraphPad Prism（版本 10）	GraphPad Software, Inc	n/a	用于图表制作和数据分析
人源口腔上皮（HOE）	Episkin	n/a（按需定制）	用于共培养模型系统的上皮组织
一次性接种环（10 µL，或等效规格）	Fisher Scientific	12870155（每包1000个）	用于固体和液体培养基的微生物培养
Microbank 菌珠	Pro-Lab Diagnostics	PL.170	微生物的保存与冷冻保藏
培养皿（90 mm）	Fisher Scientific（Sterilin）	11309283（每包500个）	用于微生物培养用琼脂平板的制备
磷酸盐缓冲液（PBS）	赛默飞世尔科技	18912014（每盒100片）	用于微生物标准化和生物膜清洗步骤的 PBS
Roswell Park Memorial Institute 1640 培养基	默克：西格玛奥德里奇	R7755-10L（适用于10 L）	生物膜培养用培养基
Schaedler厌氧琼脂基础	默克：Sigma-Aldrich（Millipore）	91019（适用于500 g）	用于制备难养厌氧琼脂平板
Schaedler厌氧肉汤	赛默飞世尔科技	CM0497B（500 克装）	用于厌氧微生物生长的液体培养基
螺口珠磨O型圈管	科学实验室用品	Z763837-1000EA（每包1000个）	用于Bead Mill 24均质器中，以裂解组织
超声波清洗机	Fisher Scientific（Fisherbrand）	n/a	用于从羟基磷灰石（HA）圆片上超声处理生物膜
Streptococcus intermedius DSM 20753	莱布尼茨学会德国微生物菌种保藏中心	n/a	用于复杂生物膜模型的一种微生物
Streptococcus mitis NCTC 12261	国家标准菌种保藏中心	n/a	用于复杂生物膜模型的一种微生物
口腔链球菌 NTCC 11427	国家标准菌种保藏中心	n/a	用于复杂生物膜模型的一种微生物
Todd-Hewitt 肉汤	默克：西格玛奥德里奇	T1438	生物膜培养用培养基
胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基	默克：西格玛奥德里奇	22092（适用于500 g）	用于好氧微生物生长的液体培养基
镊子（150 mm，不锈钢，锯齿状）	RS-Pro	545-187	用于移动HA圆盘及组织插件/组织提取物
通用管（30 mL）	Greiner Bio-One	201150（每袋400个）	用于液体培养微生物的容器
Veillonella dispar NCTC 11831	国家标准菌种保藏中心	n/a	用于复杂生物膜模型的一种微生物
β-巯基乙醇	默克：西格玛奥德里奇	M3148	组织样本中RNase的失活