评估细菌病原体在小鼠腹腔巨噬细胞中的存活情况

摘要

来源： Zhang, C. 等 细胞内感染模型的建立与评估 金黄色葡萄球菌. J. Vis. Exp. (2025)

本视频演示了在小鼠腹腔巨噬细胞中定量耐甲氧西林细菌病原体胞内存活的方法。该方法概述了感染、清除胞外细菌、宿主细胞裂解以及菌落计数等步骤，以评估细菌在宿主巨噬细胞内的存活情况。

方案

1. 胞内细菌的制备
   1. 将腹腔巨噬细胞与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）252共孵育2小时。弃去上清液，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞2次。每孔加入含100 µg/mL庆大霉素的DMEM完全培养基（1 mL），于37 °C、5% CO₂条件下孵育2小时。
   2. 弃去上清液，用PBS洗涤细胞3次。使用细胞刮刀将小鼠腹腔巨噬细胞收集至50 mL离心管中，于300 x g离心5分钟。MRSA252的胞内细菌已在腹腔巨噬细胞中成功制备。
   3. 为计算胞内细菌数量，向感染MRSA252的腹腔巨噬细胞中加入溶菌酶（10 µg/mL，参见材料表），37 °C孵育10分钟，随后用PBS洗涤2次。然后加入1 mL PBS重悬细胞，再加入0.1% Triton X-100裂解细胞5分钟。
   4. 将裂解液进行系列稀释后点种于胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板，于37 °C过夜培养。通过计数菌落形成单位，计算每只小鼠腹腔巨噬细胞中MRSA252的胞内细菌数量，结果为1.8 x 10⁶菌落形成单位（CFU）。
      注意：使用细胞刮刀收集细胞时动作应轻柔，沿单一方向刮取细胞，避免细胞破裂，以免影响后续实验。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6孔板	Corning Incorporated, USA	3516
生物危害安全设备	Heal force, China	VS-1300L-u
细胞培养箱	ESCO, Singapore	CCL-170B-8
细胞刮刀	Nest	710001
离心机 M1416R	RWD, China	M1416R
离心管	Guanghou Labselect, China	CT-002-50A
杜氏改良伊格尔培养基	Thermo Gibco, USA	C11995500BT
胎牛血清	Hyclone	SV30208.02
庆大霉素	上海生工, 中国	B540724-0010
溶菌酶	北京索莱宝, 中国	L9070
MRSA252	第三军医大学, 中国	null
青霉素-链霉素	上海碧云天, 中国	C0222
磷酸盐缓冲液	上海碧云天, 中国	ST476
生理盐水	四川科伦, 中国	null
吐温X-100	上海碧云天, 中国	P0096-100ml
胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）平板	北京奥博克生物技术有限公司, 中国	02-130
RAW264.7细胞	USA, ATCC	null