评估小鼠模型中细胞内细菌的持续存在与抗生素耐药性

摘要

来源： Zhang, C., 等，细胞内感染模型的建立与评估 Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2025)

该视频展示了分离含有金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）感染的巨噬细胞的肾脏组织，随后进行组织匀浆以释放细胞内细菌。通过计数菌落形成单位，定量分析对照组和抗生素处理组中巨噬细胞内细菌的持续存在情况。

方案

所有涉及动物模型的操作均已经过当地机构动物护理委员会和 JoVE 兽医审查委员会审核。 

1. 小鼠细胞内细菌感染
   1. 将20只Balb/c小鼠随机分为四组（n=5， 图1A).
   2. 对于第一组，注射 3 x 10⁶ 通过静脉注射，每只小鼠注射 CFU（菌落形成单位）浮游态 MRSA252。对于 II 组，注射 3 x 10⁶ CFU 浮游型 MRSA252（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌252） Staphylococcus aureus 252）和万古霉素（110 mg/kg；参见 材料表每只小鼠通过静脉注射给药。对于第三组，注射细胞内细菌 金黄色葡萄球菌 (S. aureus) 通过静脉注射。对于第四组，注射细胞内细菌 S. aureus 每只小鼠通过静脉注射给予万古霉素（110 mg/kg）。
   3. 将小鼠置于红外理疗灯下，直至其尾静脉扩张。
   4. 经静脉注射 3 x 10⁶ 每只小鼠中I组和II组浮游型MRSA252的菌落形成单位（CFU）。将细胞内细菌通过静脉注射注入III组和IV组小鼠。
      注意： 使用注射器收集含有胞内细菌的液体时，建议先用移液器轻轻将液体充分混匀，以确保所有小鼠的感染水平一致。
   5. 30分钟后，对II组和IV组每只小鼠进行静脉注射万古霉素。
2. 评估 体内 细胞内感染模型
   1. 通过计数肾脏中细菌的定植情况，评估小鼠的胞内感染模型。注射后24小时，用3%异氟烷麻醉小鼠，并通过颈椎脱臼处死。将小鼠在75%乙醇中消毒。
   2. 固定小鼠，一手用镊子提起腹部皮肤，另一手持眼科剪剪开小鼠腹部皮肤，暴露腹腔，找到肾脏并完整剥离。将肾脏置于磷酸盐缓冲液（PBS）中。
   3. 向组织研磨管中加入1 mL PBS。将每只小鼠的肾脏分别转移至不同的研磨管中，研磨至无固体组织残留。将匀浆后的组织倒入各自的Eppendorf管中，并用相应的小鼠编号标记每根管子。
   4. 使用 PBS 对组织匀浆进行系列稀释。将每个稀释度分别点样于不同的 TSA（胰蛋白胨大豆琼脂）平板上，于 37 °C 培养过夜。计数菌落并分析数据（图1B).

结果

图1： 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌252（MRSA252）胞内感染对万古霉素杀菌作用具有抗性。 （A）图示摘要，展示建立浮游细菌与胞内细菌感染模型的实验设计。图示摘要由Figdraw绘制。（B）肾脏中的细菌载量：感染后1天检测细菌载量。CFU，菌落形成单位。Vanco代表万古霉素。数据以均值±标准误表...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
牛肉提取物粉末	BBI, 英国	A600114-0500
生物安全设备	Heal force, 中国	VS-1300L-u
细胞培养箱	ESCO, 新加坡	CCL-170B-8
离心机 M1416R	RWD, 中国	M1416R
离心管	广东华科 Guanghou Labselect, 中国	CT-002-50A
庆大霉素	上海桑戈, 中国	B540724-0010
培养箱	上海恒子, 中国	HDPF-150
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 252	第三军医大学, 中国	null
青霉素和链霉素	上海碧云天, 中国	C0222
磷酸盐缓冲液	上海碧云天, 中国	ST476
生理盐水	四川科伦, 中国	null
胰蛋白胨大豆琼脂 (TSA) 平板	北京博奥拓邦生物科技有限公司, 中国	02-130
胰蛋白胨大豆肉汤 (TSB) 培养基	北京博奥拓邦生物科技有限公司, 中国	02-102K
胰蛋白胨	OXOID, 英国	LP0042B
万古霉素	上海碧云天, 中国	ST2807-250mg