从感染的巨噬细胞中分离含有磁珠标记细菌的吞噬体

摘要

来源：Gutiérrez, S., et al., 从巨噬细胞中分离含有Salmonella typhimurium的吞噬体。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了从感染的巨噬细胞中通过磁性分离法提取含有生物素–链霉亲和素包被磁珠的吞噬体。该实验方案包括缓冲液处理、细胞破碎、磁性分离和洗涤步骤，以获得用于分析的纯化吞噬体。

方案

1. 分离 S. 含伤寒沙门菌的吞噬体
   1. 配制所需体积的吞噬体分离缓冲液 A（50 mM PIPES（哌嗪-N,N-二乙磺酸），pH 6.5），加入 100 mM KCl、5 mM EGTA、2 mM MgCl₂ 和 0.1% 牛血清白蛋白）′-双(2-乙烷磺酸)，pH 7，50 mM MgCl₂₂，5 mM EGTA（乙二醇双（β-氨基乙基醚-N,N,N′，N′-四乙酸）通过添加二硫苏糖醇（DTT）至终浓度1 mM，以及细胞松弛素B至终浓度10 μM µM，以及按照制造商建议添加的蛋白酶和磷酸酶抑制剂。
      注意： DTT 和细胞松弛素 B 必须在使用前立即加入吞噬体分离缓冲液 A 中。细胞松弛素 B 可破坏细胞骨架，促进细胞膜破裂。
   2. 在预定时间点，移除感染细胞的培养基，用预热至室温的无菌 PBS（磷酸盐缓冲盐水）洗涤。
   3. 加入 750 µ每皿加入适量的吞噬体分离缓冲液A，冰上孵育20分钟。当使用不同数量的细胞时，应按比例调整分离缓冲液A的体积。
   4. 加入250 µ含50 mM PIPES（pH 7.0）、50 mM MgCl₂的吞噬体分离缓冲液B，1 L₂，5 mM EGTA、220 mM 甘露醇和68 mM 蔗糖）。轻轻摇晃培养皿，确保缓冲液覆盖整个皿表面。当使用不同数量的细胞时，应按比例调整分离缓冲液B的体积。
   5. 用橡胶刮刀轻轻刮下培养皿中的细胞，转移至预冷的1.5 mL离心管中。
   6. 使用1 mL注射器将细胞悬液通过26G针头反复吹打至少15次（吸取和推出细胞悬液各一次计为一次）。此步骤足以释放骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）的胞质内容物。不同细胞类型所需吹打次数需分别优化。
   7. 将细胞悬液置于磁力架上，静置5分钟。附着在磁铁上的颗粒即为含有包被的吞噬体。S. typhimurium悬浮液中含有其余的细胞组分。
   8. 将悬液转移至标记为的1.5 mL离心管中 "细胞质溶胶".
   9. 从磁力架上取下含有分离吞噬体的离心管，加入1 mL无菌PBS重悬吞噬体。
   10. 将吞噬体悬液置于磁力架上，静置5分钟，移除PBS。
   11. 重复洗涤分离物 S. typhimurium含吞噬体。
   12. 最后，移除PBS，并将吞噬体重悬于所需的缓冲液中（例如放射免疫沉淀分析缓冲液，RIPA缓冲液），用于蛋白质分析。约50-200 µ每份样品可获得的蛋白质量取决于初始细胞数量和感染复数（MOI），按照本方案操作可得到相应量的蛋白。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
EZ-Link NHS 生物素	赛默飞世尔科技	20217
FluidMag 链霉亲和素	Chemicell	4205
PIPES（哌嗪-N,N′-双(2-乙烷磺酸)）	卡尔·罗斯	9156.2
MgCl₂	卡尔·罗特	A537.4
EGTA（乙二醇双(β-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸）	卡尔·罗斯	3054.3
蔗糖	Carl Roth	4621.1
甘露醇	卡尔·罗斯	4175.1
DTT（二硫苏糖醇）	Sigma	43816
蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物	赛默飞世尔科技	1861280
细胞松弛素B	Sigma	C6762
DYNAL 或 DynaMag 磁铁	赛默飞世尔科技	12321D
鼠伤寒沙门氏菌 SL1344	德国微生物和细胞培养物保藏中心-莱布尼茨研究所
RPMI（罗斯韦尔公园纪念研究所）	Biochrom	FG1415
PBS（磷酸盐缓冲液）	Biochrom	L1825
Cy5-链霉亲和素	Invitrogen	SA1011