克隆分离及PCR筛选保留靶基因的GFP切除型重组疱疹病毒

摘要

来源： Tang, N., et al. 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建重组禽疱疹病毒载体. J. Vis. Exp. (2019)

本视频演示了在绿色荧光蛋白（GFP）标记物发生位点特异性切除后，重组疱疹病毒的克隆分离及基于PCR的筛选。采用荧光激活细胞分选技术分离无荧光的感染细胞，并通过连接区PCR确认GFP阴性克隆中目标基因的保留。

方案

噬菌斑纯化

1. 荧光激活细胞分选
   1. 分选前一天，向两块96孔板中接种细胞，每孔接种2 × 10⁴个鸡胚成纤维细胞（CEF），每孔接种量相同。
   2. 感染后72小时，准备用于分选的感染细胞。将单个无荧光信号的细胞分选至已接种CEF的96孔板中。
2. 重组病毒传代与PCR验证
   1. 分选后第5天，挑选5–10个单个无荧光空斑，用50 µL胰蛋白酶-EDTA溶液在38.5 °C下消化3分钟，随后加入50 µL培养基重悬细胞。
      注意：代表性GFP阴性空斑请见图1B。
   2. 将一半细胞接种至预先接种了CEF的6孔板各孔中，作为第二代培养。
   3. 将每个克隆剩余的细胞在200 × g条件下离心5分钟，弃去上清液，用50 µL裂解缓冲液重悬细胞，用于DNA提取。
   4. 使用5'连接区引物，取1 µL DNA模板进行PCR扩增。每个样本在冰上配制以下20 µL反应体系：2× PCR预混液（10 µL）、10 µM上游引物（0.5 µL）、10 µM下游引物（0.5 µL）、DNA模板（1 µL）和无核酸酶水（8 µL）。扩增程序为：95 °C预变性2分钟；95 °C变性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸40秒，共35个循环；72 °C终延伸7分钟。取2 µL扩增产物上样至1%琼脂糖凝胶的一个孔中进行电泳分析。
      注意：5'连接区PCR的代表性结果请见图1B。
   5. 根据PCR结果，选取三个至五个阳性重组HVT克隆进行后续传代与验证。

结果

图1：重组HVT的验证。 （A）该图显示在荧光显微镜下观察到的GFP阳性斑块（HVT-GFP-VP2）（上图），以及使用引物VP2-F和UL46-R1对3'连接处进行PCR验证的结果。（B）该图显示通过Cre重组酶切除GFP后获得的斑块（HVT-VP2），以及使用引物UL45-F1和VP2-R1对5'连接处进行PCR验证的结果。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HVT Fc126 毒株	禽病与肿瘤学实验室		野生型 HVT 病毒
GoTaq 预混液	Promega	M7123	连接区 PCR 扩增
Platinum Pfx DNA 聚合酶	Thermofisher	11708021	完整插入片段的 PCR 扩增
共聚焦激光扫描显微镜	Leica Microsystems	Leica TCS SP5 LASAF	免疫荧光
FACS 细胞分选仪	BD biosciences	BD FACSAria	单细胞分选