分离 节杆菌属 从土壤样品中分离噬菌体

摘要

来源：Cross, T., et al. 一种从土壤样本分离物中分离Arthrobacter噬菌体物种的优化富集技术。J. Vis. Exp. (2015)。

本视频演示了分离 节杆菌属 利用富集法和噬斑测定技术从土壤样品中分离噬菌体。该方法重点展示噬菌体对宿主菌的感染、扩增过程，以及在细菌菌苔上形成清晰溶菌区（噬斑）的可视化结果。

方案

1. 噬菌体分离

1. 向每个锥形瓶中加入 1 至 2.5 ml 处于对数期末期/稳定期初期的细菌培养物。若 OD₆₀₀ 为 0.5–0.7，使用 1 ml 菌液；若 OD₆₀₀ 高于 0.7，使用 2.5 ml 菌液。
   注意：处于对数期生长的细胞通常比处于稳定期生长的细胞产生更多的噬菌体且滴度更高。
2. 将锥形瓶置于摇床培养箱中，30 °C、250 rpm 振荡培养约 24 小时。
3. 培养 24 小时后，从摇床培养箱中取出富集用锥形瓶，并用噬菌体缓冲液将富集样品稀释十倍。
4. 在培养管中加入 0.5 ml 处于对数期末期/稳定期初期的细菌培养物，并向各管中加入不同体积的富集培养物（在 PB 中进行 10 倍稀释后取 5 µl 至 500 µl）。
   注意：建议测试较宽范围的浓度，因为每个土壤样品在富集后产生的噬菌体滴度各不相同。
5. 向培养管中加入 CaCl₂，使其终浓度与原始富集瓶中的浓度一致。使用一系列不同浓度的 CaCl₂，以筛选出具有不同 CaCl₂ 依赖性的多种噬菌体。
   注意：大多数噬菌体可在 1–2.5 mM CaCl₂ 范围内被分离获得，但也有部分噬菌体在 0–50 mM CaCl₂ 浓度范围内均可被有效分离。因此，为最大化获得独特的 Arthrobacter 噬菌体数量，最好检测一系列 CaCl₂ 浓度。
6. 在培养管中混入 4.5 ml LB 上层琼脂，然后将混合物倒入 LB 琼脂平板中。轻轻旋转平板使上层琼脂均匀分布，静置约 15 分钟使其凝固。
   注意：上层琼脂可批量制备（如 250 ml），多余部分可在室温下保存，并在后续实验中重复使用，至少可稳定两周。尽管存在多种上层琼脂配方，本实验采用的是将 7 g/L 琼脂溶于 LB 培养基中制得。实验过程中可将上层琼脂置于 60 °C 水浴中以维持液态。
7. 将平板倒置，在所需温度下（通常为 30 °C）过夜（O/N）至 48 小时进行培养。可根据所含噬菌体特性调整这些条件以优化结果。大多数分离得到的噬菌体来自在 30 °C、含 1–2.5 mM CaCl₂ 的条件下培养 24 小时后的平板。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LB 肉汤粉末	Fisher	BP9722-2	建议批量订购。
颗粒状琼脂	Fisher	BP1423-2	建议批量订购。
0.22 µm 注射器滤器	Fisher	09-719A
0.22 µm 布氏滤器	Fisher	430320	通过小心更换接收管，可获得超过 50 ml 的液体。
Eppendorf 管	Fisher	05-408-129
5 ml 单独移液管	Fisher	13-678-11D
50 ml 锥形管	Fisher	76002844
15 ml 锥形管	Fisher	76002845
10 ml 单独移液管	Fisher	13-676-10J
25 ml 单独移液管	Fisher	13-676-10K
Whatman 定性滤纸	Fisher	1001-824