准备细胞以分析抗病毒药物的细胞内摄取与活性

摘要

来源：Allaire, A., et al．利用免疫荧光监测人乳铁蛋白的细胞摄取及其对丙型肝炎病毒的抗病毒活性．J. Vis. Exp．(2015)。

该视频演示了制备细胞以评估抗病毒药物对丙型肝炎病毒的细胞内摄取及活性的实验步骤。

方案

1. 细胞准备与处理

1. 在24孔板中，将玻璃盖片置于各孔底部，每孔用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。
2. 在每孔中接种支持丙型肝炎病毒（HCV）亚基因组复制子的Huh-7细胞，密度为5 × 10⁴ 个细胞/孔。若无需处理，可接种更高密度的细胞。培养基为添加10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠和250 mg/ml G-418（用于维持复制子）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。
3. 在37 °C、5% CO₂条件下培养。次日，用从人乳中纯化的人乳铁蛋白（hLF）以3 µM浓度处理细胞。

2. 多聚甲醛/蔗糖溶液配制（12% PFA 和 12% 蔗糖）

1. 取500 ml PBS置于烧杯中，加热至20 °C至30 °C之间。将60 g蔗糖溶于PBS中。再将60 g多聚甲醛（PFA）溶于PBS/蔗糖溶液中。缓慢加入2N氢氧化钠（3至7 ml），直至溶液变澄清。
2. 用盐酸调节pH至7.4，用PBS定容至500 ml。使用Whatman滤纸通过重力过滤。使用前，用PBS稀释该溶液，使其终浓度为4% PFA和4%蔗糖（4 °C保存，最多1周）。
3. 在预定时间点（处理0 hr、2 hr或24 hr），用PBS洗涤细胞两次（每次1 min），然后在室温下用PBS/4% PFA/4%蔗糖固定20 min。细胞通常处于30–40%汇合度，使用细胞数量为1.5 × 10⁵个。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Wisent	319-005-CL
多聚甲醛（PFA）	BioShop	PAR070.1	易燃固体，皮肤刺激物，对肺部和眼睛有害
磷酸盐缓冲液（PBS）	Wisent	311-425-CL	不含钙离子和镁离子
人乳铁蛋白（hLF）	Sigma	L0520