活体成像观察HIV-1感染人巨噬细胞中吞噬体的迁移

摘要

来源：Lê-Bury, G., 等. 在感染HIV-1的活体人原代巨噬细胞中测量吞噬体迁移与速度。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了对感染 HIV-1 的人巨噬细胞进行活细胞共聚焦成像，通过 GFP 荧光和明场追踪技术来观察和量化吞噬体的迁移，从而揭示 HIV 如何在 Fc 受体介导的吞噬作用过程中改变细胞内运输。

方案

1. 活细胞视频显微镜吞噬作用检测

1. 使用共聚焦成像系统，例如配备有37°C、含CO₂的加热培养室的转盘式共聚焦显微系统₂ 通过装有水的瓶子进行加湿。
2. 在实验开始前打开加热腔，使显微镜载物台在吞噬作用检测开始前达到37 °C。打开显微镜和计算机，并启动成像软件。
3. 优化成像设置，例如扫描速度、放大倍数、分辨率 等 每视野至少包含一个细胞，并在60至120分钟之间每隔一分钟拍摄一帧图像。
   注意： 此处使用63倍物镜，每分钟拍摄一帧，共成像60分钟。
4. 将成像培养皿置于显微镜载物台上。调节焦距和位置，使视野中仅包含一个完整的HIV-1（人类免疫缺陷病毒-1）感染的巨噬细胞。根据所使用的成像系统和探针，设置适当的激发/发射参数。包含明场（BF）通道以观察吞噬体图1ii通过调整透射光百分比和曝光时间，优化各通道图像的显示效果。
   注意： 此处使用491 nm激光激发NLR4.3 HIV-1 Gag-iGFP（绿色荧光蛋白），激光功率为20%，曝光时间为50毫秒图1i).
5. 移除成像培养皿，加入1 ml浓度为7 x 10⁷的SRBC（绵羊红细胞）悬液⁶ SRBCs/ml 加入培养皿（图1).
6. 在室温下以 500 x g 离心 2 分钟以同步吞噬作用，记录此次离心结束的时间，并将培养皿放回显微镜载物台。
7. 每分钟采集一次Z轴层扫图像（以0.3 µm为步进，贯穿细胞厚度，通常采集20个层面），优化焦平面并获取GFP和明场图像，持续至少1小时。将延时视频以所用成像系统的原生文件格式保存。
   注意： 此处，延时录像以原始格式 *.stk 文件保存。

结果

图1. 用于吞噬成像的对照组和HIV感染hMDMs的制备。 通过贴壁法纯化单核细胞（1），并在M-CSF存在下分化为巨噬细胞，持续11天（2）。随后，使用NLR4.3 HIV-1Gag-iGFP i）以0.02至0.03的感染复数（MOI）感染hMDMs，感染持续8天，并在第2天进行换液清洗（3）。（4）将IgG调理的SRBCs加入hMDMs中，共孵育1小时以诱导吞噬作用。含有SRBCs的吞噬体可在明场（BF）图像中被识别（红圈，ii）。图像来源于Servier图片数据库。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 mm 未包被玻璃底培养皿 1.5	MatTek corporation	P35G-1.5-14-C Case	用于成像采集
RPMI 1640 培养基，无酚红（10×500 ml）	Life technologies	11835-105	使用前于 37 °C 水浴中预热；用于吞噬作用检测
绵羊红细胞（SRBCs）	Eurobio	DSGMTN00-0Q	使用前以 Alsever 缓冲液保存于 4 °C
共聚焦转盘成像系统 CSU-X1M1	Yokogawa
491 nm 50 mW 激光器	COBOLT CALYPSO