利用无细胞转录-翻译系统合成噬菌体

摘要

来源： Rustad, M., 等. 在体外合成具有感染性的噬菌体 大肠杆菌-基于细胞的无细胞表达系统 视觉实验杂志. (2017).

本视频展示了利用无细胞转录-翻译（TXTL）系统合成噬菌体的方法。通过将细菌粗提物、能量混合物、氨基酸混合物、DNA降解酶抑制剂以及噬菌体DNA混合配制为预混液，随后进行孵育。体外分子机制可实现病毒蛋白的表达和DNA复制，并组装形成新的噬菌体颗粒。

方案

1. 无细胞反应

注意：无细胞转录-翻译（TXTL）反应由33%的粗制Escherichia coli提取物（蛋白质浓度为8.9–9.9 mg/mL）组成，其余67%为反应缓冲液和噬菌体基因组。最终反应条件如下：8.9–9.9 mg/mL蛋白质（来自粗提物），3–6 mM 镁离子或谷氨酸镁，40–100 mM 钾离子或谷氨酸钾，2–4% 聚乙二醇（PEG）8000，每种氨基酸3–4 mM，以及一种能量混合溶液，包含0.33–3.33 mM 二硫苏糖醇（DTT）、50 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）、1.5 mM 三磷酸腺苷（ATP）和三磷酸鸟苷（GTP）、0.9 mM 三磷酸胞苷（CTP）和三磷酸尿苷（UTP）、0.2 mg/mL 转运核糖核酸（tRNA）、0.26 mM 辅酶A（CoA）、0.33 mM 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、0.75 mM 环磷酸腺苷（cAMP）、0.068 mM 亚叶酸、1 mM 精脒和30 mM 3-磷酸甘油酸（3-PGA）。DNA型噬菌体所需的基因组浓度为0.5–10 nM，RNA型噬菌体则需要50–150 nM的浓度范围。最终反应浓度因所合成的特定噬菌体而异，但均在上述范围内。为确保反应体系充分供氧，最终反应体积应控制在10–20 µL之间。反应方案存在细微差异，具体取决于基因组分子的形式。例如，线性基因组分子需要在反应中额外添加组分，以抑制粗提物中存在的recBCD酶对线性DNA片段的降解作用。

1. 完成 "反应细节" 切片 表1 通过输入反应总数和反应的最终体积。
2. 通过确定反应中的恒定组分和可变组分来设计实验。输入主混合液的分数体积百分比，即恒定反应组分总体积与最终反应体积和样本数量乘积的比值。在表格中输入反应试剂的储备浓度和最终浓度 "主混合反应配方" 部分在 表1输入待测试的可变试剂的储备浓度和终浓度。
   注意反应组分的体积将根据预混液的体积和每个单独反应的终体积自动计算。
3. 移除所需数量的试管（数量见标注） "用于解冻的试管" 部分 表1从-20 °C或-80 °C取出粗细胞提取物、能量缓冲液混合物和氨基酸混合物，在冰上解冻。
   注意解冻后，如有需要，将相同组分的多个等分试样混合。
4. 将指定体积的粗提物（占终反应体积的33%）分装至微量离心管中。
5. 按照说明制备主混合液 表1. 在所有组分中进行匀浆处理 "主混合反应配方" 通过涡旋混合。将每种组分的适当体积加入粗提物中。
6. 若操作的噬菌体具有线性DNA基因组（例如， T7），向反应体系中加入1 µM的λ噬菌体gam蛋白。涡旋混匀溶液，将反应管置于冰上孵育5分钟。这可以抑制粗提物中内源性的recBCD复合物对线性DNA片段的降解。
7. 添加最后一个组分后，按照 表1，通过涡旋振荡混匀反应液。然后，将总反应混合液分装至 n 微量离心管
   注意每个分装体积等于分装主混合物体积百分比与反应终体积的乘积。例如，当分装主混合物体积百分比为90%，反应终体积为12 µL时，每个分装体积为10.8 µL。
8. 将指定体积的可变组分加入主混合物阵列中（参见 表1)。向每个反应体系中加入水，以达到所需的最终反应体积。通过涡旋振荡使每个反应体系混匀。将微量离心管在29 °C下孵育至少8小时或过夜。 

表1：反应组成。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
超速离心管	Beckman Coulter	344057
锥形管	Falcon	352070
培养管	Fischerbrand	14-961-33
无细胞系统	Mycroarray Inc	Mytxtl
BioComp 梯度制备仪	BioComp Instruments	Model 105ME