使用蔗糖密度梯度纯化噬菌体

摘要

来源： Rustad, M., 等. 感染性噬菌体的合成 大肠杆菌-基于细胞的无细胞表达系统 视频实验杂志 (2017)

本视频演示了利用蔗糖密度梯度从含有宿主细菌碎片的悬液中纯化噬菌体的方法。该方法展示了密度梯度如何根据噬菌体的浮力密度进行分离，从而获得可见的条带，以便重新悬浮并进行后续分析。

方案

1. 噬菌体的纯化

注意： 蔗糖纯化的效率在很大程度上取决于噬菌体的大小。需要根据待分离噬菌体的质量进行考量，并对梯度条件作出相应调整。采用此方法可轻松达到每毫升超过10¹³ 噬菌体的最终病毒滴度。

1. 在1× TM缓冲液中配制12 mL的5%和45%（w/v）蔗糖溶液。
2. 通过移液枪将2.5 mL 45%蔗糖溶液加入4根超速离心管中，制备4组4×5 45%蔗糖梯度。随后在每管中加入约2.6 mL 5%蔗糖溶液，直至液面距离管口边缘2 mm处停止。
   注意： 将移液枪枪头接触蔗糖溶液表面，极其缓慢地排出液体。较轻的蔗糖溶液会浮在较重溶液之上，形成清晰的界面。若在背光条件下观察，正确分层的溶液界面宽度约为1 mm。
3. 使用梯度形成仪以23 rpm的转速在86°倾斜条件下旋转混匀梯度，持续43秒。若不立即使用，用石蜡膜覆盖后于4 °C保存。
4. 用1 mL移液器从每个制备好的蔗糖梯度顶部移除500 µL，并将离心管平衡至±0.002 g以内。
5. 合并所有试管中的噬菌体悬液。使用1 mL移液器，将悬液缓慢加入蔗糖梯度顶部：将吸头接触液面，极缓慢地将500 µL悬液释放到蔗糖梯度表面，注意避免因快速移液导致混合。在4 °C下以70,000 x g离心20分钟。
   注意： 将制备好的梯度液平衡至±0.002 g以内。较小的噬菌体可能需要长达1小时。
6. 使用无菌注射器和钝头套管切下噬菌体条带。
   注意： 从侧面观察时，噬菌体条带比周围区域更厚且呈乳白色，高度约为5 mm，位于离心管中点位置。
   1. 将钝头套管浸入溶液中，直至管尖对准噬菌体条带最上缘的中心位置。通过拉动注射器活塞，吸出大部分噬菌体条带。
7. 将含有悬浮噬菌体的蔗糖溶液加入3-4个超速离心管中，每管不超过1.5 mL。用预冷的1×TM缓冲液加至距离管顶约3-4 mm处。用石蜡膜封口后颠倒混匀。将离心管放回超速离心机，在4 °C、145,000 × g条件下离心1小时以形成沉淀；较小的噬菌体可能需要长达2小时。
8. 迅速倒出上清液，并将离心管倒置在一次性擦拭纸上沥干。用无菌棉签擦拭管内壁，以去除残留的上清液。
9. 将 200–400 µL 冷的 1x TM 均匀分装至各沉淀中，于 4 °C 下重悬过夜；无需振荡。
   注意： 如果沉淀物不干净， 例如， 膜碎片、DNA的丝状物 等等。，合并后在微型离心机中于17,000 x g条件下进行额外离心。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
超速离心管	Beckman Coulter	344057
锥形管	Falcon	352070
梯度混合仪	BioComp Gradient Master	见 Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9.
注射器和钝头针头	Monoject	8881513918 和 888202017