扩增与回收感染性噬菌体

摘要

来源： Rustad, M. 等 合成具有感染性的噬菌体 大肠杆菌-基于细胞的无细胞表达系统 视频实验杂志 (2017)

本视频演示了从大肠杆菌（E. coli）培养物中扩增并回收具有感染性的噬菌体的过程。内容涵盖了噬菌斑分离、噬菌体复制、可控裂解及纯化的操作步骤。

方案

1. 噬菌体扩增

注意： 单斑、多周期（SPMC）噬菌体生产技术在T4噬菌体中已有充分描述。以下噬菌体扩增与脱氧核糖核酸（DNA）提取方法是一种适用于多种噬菌体的通用方案 大肠杆菌 (E. coli双链DNA噬菌体， 例如，T7，T4 或 L。该方案的最终成功在很大程度上取决于所选宿主菌株在超感染条件下的耐受能力。如果宿主细胞在超感染条件下不稳定，或未能实现超感染，且在此关键阶段始终未发生裂解，则建议采用完全裂解方案。该方案包括通过高速离心分离细胞碎片，并在超速离心条件下沉淀噬菌体。以下所有条件和参数仅作为通用起始参考。针对本地宿主细胞系的最优条件可能有所不同；应确定并严格遵循适当的条件。

1. 准备接种细胞
   1. 在15 mL培养管中接种10 mL LB（Luria-Bertani）培养基 E. coli 宿主细胞， 例如，B 或 K12。
   2. 置于摇床中，设置转速为250 rpm，温度为37 °C，培养过夜至饱和生长。
2. 单斑、多周期噬菌体生长与浓缩
   1. 为制备含有感受态噬菌斑的平板，将多个LB-琼脂平板在37 °C下预热1小时，或过夜。
   2. 制备噬菌体原液的多个稀释度（例如， T7、T4 或 L）加入已知浓度的 LB 培养基中，目标为约 ~10²-10³ 噬菌体/mL
   3. 向每块平板中加入100 µL浓缩的宿主细胞过夜培养物。
   4. 选择适当体积的已制备噬菌体稀释液，使其对应每平板10-100个噬菌体的范围。将所需体积的噬菌体稀释液加入每个平板中（例如，100 µL 的 10³ 噬菌体/mL；此浓度应产生约100个噬菌斑）。将平板置于37 °C培养，并开始计时（+0 h）。培养4–5 h。
   5. 在250 mL锥形瓶中加入49 mL LB培养基，置于摇床中，设置转速为250 rpm，温度为37 °C。
   6. 在 +2.5 小时，将过夜培养的饱和菌液 1 mL 加入预热的含有 49 mL LB 培养基的锥形瓶中，使细胞稀释 50 倍。当细胞进入对数生长期（+4–5 小时）时，测定 600 nm 波长处的吸光度（OD₆₀₀). 使用转换 OD 确定细胞浓度₆₀₀ 1.0 = 8 × 10⁸ 细胞/毫升
   7. 稀释至 2 x 10⁷ 细胞/mL，并使用额外的LB培养基稀释。从培养箱中取出含有噬菌斑的琼脂平板，立即用无菌巴斯德吸管末端切取单个噬菌斑并移除。将噬菌斑吹入稀释的细胞中，在37 °C继续孵育2小时（共6–7小时）。
   8. 通过取500 µL样品至1.5 mL离心管中，加入10 µL氯仿（CHCl₃），检测是否完全感染₃），并立即高速涡旋振荡。观察溶液是否变得澄清。待细胞完全感染后，再继续孵育 2 小时（+ 8–9 小时）。注意： 如果细胞已被完全感染，它们将迅速裂解（<2 分钟）并澄清溶液。其他结果也被考虑在内 讨论 部分 如下所述。细胞将被超级感染，但在该阶段之前不会发生裂解。如果开始出现裂解，必须立即加入DNase并开始离心收集，以防止噬菌体降解。
   9. 加入DNase至终浓度5 µg/mL，在4 °C、8,000 × g条件下离心收集细胞沉淀。弃去上清液。将沉淀重悬于10 mL 1× TRIS氯化镁（TM）缓冲液（50 mM Tris，pH 7.8，10 mM MgCl₂）中₂) 缓冲液中加入 5 µg/mL DNase。加入 500 µL CHCl₃ 高速涡旋以裂解细胞。在4 °C下以12,000 × g离心10分钟，澄清裂解液。将上清液倾入15 mL锥形管中，于4 °C保存。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
超速离心管	贝克曼库尔特	344057
锥形管	Falcon	352070
培养管	菲舍尔布兰德	14-961-33
LB 琼脂平板配方			25 g/L LB 培养基（Luria-Bertani medium，LB Broth, Miller - Fisher BioReagents 产品编号 BP1426）和 15 g/L Bacto-Agar 固体培养基（Brenton, Dickenson and Company - 产品编号 214010）。