利用胚胎肾细胞生成重组病毒颗粒

摘要

来源：Vijayraghavan, S., Kantor, B. 一种用于分裂细胞中CRISPR/Cas9介导基因敲除的整合酶缺陷型慢病毒载体的制备方案。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频演示了通过将编码病毒蛋白和目的基因的质粒转染胚胎肾细胞，以产生重组病毒颗粒的实验步骤。

方案

1. 使用磷酸钙法转染人胚胎肾细胞（HEK-293T）
   1. 转染试剂
      1. 制备2×BES缓冲溶液BBS（50 mM BES，280 mM NaCl，1.5 mM Na₂HPO₄），将 16.36 g NaCl 与 10.65 g BES（N, N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙烷磺酸)和0.21克Na₂HPO₄. 加入双蒸水 H₂O (dd-H₂O）加水定容至900 mL，溶解后用1 M NaOH滴定至pH 6.95，再加水定容至1 L。使用0.22 µm滤器过滤。于-20 °C保存。
      2. 制备1M CaCl₂₂通过0.22 µm滤器过滤溶液，4 °C保存。
2. 观察前一天接种的培养皿。当细胞融合度达到70%–80%时，即可进行转染。
3. 吸出培养板中的旧培养基，轻轻加入新鲜配制的无血清培养基。
4. 通过将四种质粒分装至一个15 mL圆锥形离心管中来制备质粒混合物。对于单个15 cm培养皿的制备，使用37.5 µg CRISPR/Cas9转移载体（pBK198或pBK189）、25 µg pBK43（psPAX2-D64E）、12.5 µg pMD2.G以及6.25 µg pREV。图1c).
5. 加入 312.5 µL 1M CaCl₂₂ 加入质粒混合物中。向其中加入最多1.25 mL的无菌dd-H₂O₂O.
6. 在涡旋混合的同时，缓慢（逐滴）加入1.25 mL的2x BBS溶液。室温孵育30分钟。
7. 将转染混合物逐滴加入每个15 cm培养皿（每皿2.5 mL）。轻轻摇晃培养皿混匀，于37 °C、5% CO₂条件下孵育₂ 孵育2-3小时。随后，每孔加入2.5 mL（10%）血清，继续孵育过夜（12-18小时）。
   注意：一些实验室使用 3% CO₂ 使用培养箱以稳定培养基的pH值。然而，我们未观察到3%与5% CO₂条件下的转染效率存在任何差异。₂。此外，CaPO的尺寸₄ 沉淀物的存在对转染效率至关重要；转染混合液在加入细胞前必须保持澄清。若孵育过程中混合液变浑浊，请重新配制新鲜的2×BBS（pH = 6.95）。

转染后第2天

1. 观察细胞，确保此时细胞融合度接近100%，且几乎无细胞死亡。每孔加入25 mL新鲜DMEM + 10%血清更换培养基。继续在37 °C、5% CO₂条件下培养48小时。

结果

图1：IDLV包装。 (a) 野生型整合酶蛋白的示意图 (b) 修饰后的质粒源自psPAX2。对整合酶突变克隆进行筛选的代表性琼脂糖凝胶图像。使用标准质粒DNA提取小量试剂盒制备DNA（脱氧核糖核酸）样品，并用EcoRV和SphI酶切分析。正确酶切的克隆（编号5，红色虚线框）通过直接（Sanger）测序进一步验证了INT基因中D64E的替换。整合酶缺陷型包装盒被命名为pBK43。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 mm 细胞培养皿（经TC处理）	Corning	430167
组织培养移液管，5 mL	Corning	4487
组织培养移液管，10 mL	Corning	4488
组织培养移液管，25 mL	Corning	4489
血细胞计数板及盖玻片	Cole-Parmer	UX-79001-00
人胚胎肾293T（HEK 293T）细胞	ATCC	CRL-3216
293FT细胞	Thermo Fisher Scientific	R70007
DMEM高糖培养基	Gibco	11965
胎牛血清（Cosmic Calf Serum）	Hyclone	SH30087.04
抗生素-抗真菌溶液，100倍浓度	Sigma Aldrich	A5955-100ML
丙酮酸钠	Sigma Aldrich	S8636-100ML
非必需氨基酸（NEAA）	Hyclone	SH30087.04
RPMI 1640培养基	Thermo Fisher Scientific	11875-085
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
0.05%胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25300054
BES（N,N-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸）	Sigma Aldrich	B9879 - BES
明胶	Sigma Aldrich	G1800-100G
psPAX2	Addgene	12260
pMD2.G	Addgene	12259
pRSV-Rev	Addgene	12253
lentiCRISPR v2	Addgene	52961
BES缓冲液