感染上皮细胞中病毒双链RNA与宿主模式识别受体的可视化

摘要

来源：Mateer, E., 等，负链RNA病毒感染中双链RNA与模式识别受体的共聚焦成像。J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了病毒感染的上皮细胞中病毒双链RNA（dsRNA）和胞质模式识别受体（PRRs）的共聚焦成像。重点说明了基于抗体的荧光标记如何揭示病毒复制中间体与宿主免疫感受器之间的相互作用。

方案

1. 固定与免疫染色

1. 吸弃培养基。每孔加入 1 mL 含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻冲洗细胞。
2. 移除 PBS。每孔加入 1 mL 预冷至 -20 °C 的甲醇（MeOH），于 -20 °C 或干冰中孵育 15 分钟。
3. 移除甲醇。
4. 每孔加入 1 mL PBS，在 4 °C 下轻轻振荡洗涤 5 分钟。重复洗涤，共洗涤 4 次。
5. 将盖玻片上的固定细胞置于 1 mL 0.2% t-辛基苯基聚氧乙烯醚中，在 4 °C 下轻轻振荡洗涤 5 分钟。
6. 每孔加入 1 mL PBS，在 4 °C 下轻轻振荡洗涤 5 分钟。重复洗涤步骤，共 4 次。
7. 为检测双链 RNA（dsRNA）和 MDA5（黑色素瘤分化相关蛋白 5），将样本在 200 μL 含 3% 牛血清白蛋白（BSA）的稀释液中与一抗孵育。抗 dsRNA 9D5 抗体按 1:2 稀释，抗 MDA-5 抗体按 1:250 稀释。在 4 °C 下轻轻振荡孵育过夜。
8. 移除一抗，每孔用 1 mL PBS 在室温（RT）下轻轻振荡洗涤 5 分钟。重复此洗涤步骤 4 次。
9. 每孔加入 200 μL 用 3% BSA 稀释的二抗（1:2,000 稀释），在室温下孵育 1 小时。
10. 移除二抗，每孔用 1 mL PBS 在室温下轻轻振荡洗涤 5 分钟。重复此洗涤步骤 4 次。
11. 为检测 JUNV 核蛋白（NP）和 RIG-I，每孔加入 200 μL 用 3% BSA 稀释的偶联抗体。偶联抗 JUNV NP（AG-12）抗体按 1:1,000 稀释，在室温下轻轻振荡孵育 2 小时；偶联抗 RIG-I 抗体按 1:500 稀释，在 4 °C 下轻轻振荡孵育过夜。
12. 移除偶联抗体，每孔用 1 mL PBS 在室温下轻轻振荡洗涤 5 分钟。重复此洗涤步骤 4 次。
13. 用 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（1:1,000）在室温下轻轻振荡染色 3 分钟，对盖玻片进行复染。
14. 在 1 mL 0.5% t-辛基苯基聚氧乙烯醚中于室温下轻轻振荡洗涤 3 次，每次 5 分钟。
15. 在 1 mL PBS 中于室温下轻轻振荡洗涤 2 次，每次 5 分钟。
16. 在 1 mL ddH₂O 中于室温下轻轻振荡洗涤 1 次，持续 1 分钟。
17. 用封片剂将盖玻片封固于载玻片上，室温静置过夜使其固化。
18. 用指甲油封片，室温晾干 1 小时。
19. 使用共聚焦显微镜，配备 60x/1.42 数值孔径的油镜，对各样本采用相同的激光发射参数进行成像。
20. 分析数据时，如有必要，对所有样本使用相同的线性调整方式调节亮度和对比度。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
APEX Alexa Fluor 647 抗体标记试剂盒	Invitrogen	A10475
BSA（牛血清白蛋白）	Sigma Aldrich	A4503
DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）	Cell Signaling	4083	1:1,000 稀释
驴抗兔 Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-11058	1:2,000 稀释；批号 #: 1454437
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Corning	10-013-CV
胎牛血清	Atlanta Bio	S11150
玻璃显微镜载玻片	Fisher	12-550-15
羊抗鼠 Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11029	1:2000 稀释；批号 #: 1874804
人肺上皮 A549 细胞	ATCC	CCL-185
甲醇	Fisher	A412	储存于 -20 °C
鼠单克隆抗体抗 JUNV NP	BEI	NA05-AG12	与 Alexa-647 偶联，使用 1:1,000 稀释
鼠单克隆抗体 pan-Enterovirus 9D5 试剂	Millipore Sigma	3361	即用型；稀释至 1:2；批号 #: 3067445
含 Ca 和 Mg 的 PBS	Corning	21-030-CV
PDL 包被盖玻片	Neuvitro	H-12-1.5-pdl
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen	P10144
兔单克隆抗体 MDA-5	Abcam	ab126630	1:250 稀释；批号 #: GR97758-7
重组 JUNV Candid#1 毒株	实验室制备	实验室制备	如参考文献 13 中所述
与 Alexa-594 偶联的 RIG-I 鼠单克隆抗体	Santa Cruz	sc-376845	1:1000 稀释；批号 #: AO218
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787