利用流式细胞术对EBV感染的细胞系进行表型分析

摘要

来源：Xu, C., et al. 建立慢性活动性EB病毒感患者NK细胞和T细胞系的高效简便方法。J. Vis. Exp. (2018)。

本视频展示了利用流式细胞术对EBV感染的T细胞和NK细胞系进行表型分析，重点介绍了样本制备、抗体染色及数据分析步骤，以鉴定谱系特异性表面标志物。视频还展示了如何通过标志物表达谱确认不同的T细胞和NK细胞群体。

方案

所有涉及样本采集的操作均按照本机构的IRB指南进行。

1. 通过流式细胞术进行细胞表型分析

1. 当细胞扩增后，收集 1×10⁶ 个细胞以确定细胞系的表型。在室温下以 240 x g 离心 5 分钟（NK/T 细胞将沉淀至管底）。
2. 弃去上清液，加入 7 mL PBS 重悬沉淀。在室温下以 240 x g 离心 5 分钟。重复一次。
3. 向每管中加入 200 µL 人血清，充分混匀，并在室温下孵育 10 分钟。
4. 在室温下以 240 x g 离心 5 分钟。弃去上清液，用冷 PBSA（PBS + 0.2% BSA）将细胞重悬至 1×10⁶/mL。将细胞分装至 5 支试管中，每管含 2×10⁵ 个细胞。
5. 在 4 °C 下以 240 x g 离心 5 分钟。弃去上清液，用 PBSA 缓冲液或含 10 µL PE（或 PE-Cy7）和 10 µL FITC 标记抗体的 PBSA 重悬细胞，在冰上染色 T 或 NK 细胞的细胞受体，如 图 1 所示。仅用 PBSA 缓冲液重悬的细胞作为阴性对照。
6. 将细胞与抗体在冰上避光孵育 20–30 分钟。
7. 用冷 PBSA 洗涤细胞两次，最后用 300 µL 冷 PBSA 重悬细胞。
8. 使用流式细胞仪分析细胞表型。
   1. 在 "创建工作表" 条件下设置流式细胞仪。使用显示前向散射光（FSC）与侧向散射光（SSC）的点图建立实验模板。
   2. 加载同型对照管以优化 FSC 和 SSC 电压，并优化 FSC 阈值，以去除碎片信号，同时不干扰目标细胞群。删除除 FSC、SSC、FITC、PE 和 PE-Cy7 以外的所有参数。
   3. 在每组双色分析中，使用同型对照和单一阳性对照进行补偿调节。
   4. 加载样本，生成 HLA-DR 对 CD19、CD4 对 CD8、CD56 对 CD16 以及 CD3 对 CD16 的点图，以显示不同细胞亚群。
      注意： 使用 PBMC 进行补偿调节，所用对照包括阴性/同型对照和单一阳性对照。常规采用流式细胞仪进行双色免疫荧光分析，以检测表面标志物的表达。所用抗体包括：抗 HLA-DR、抗 CD4、抗 CD16 与异硫氰酸荧光素（FITC）偶联、抗 CD8、抗 CD56、抗 CD3 与藻红蛋白（PE）偶联，以及抗 CD19 与 PE-Cy7 偶联。

结果

图1：L196和M296细胞系流式细胞术分析的代表性设门策略。 使用外周血单个核细胞（PBMC）调整FSC和SSC电压。在FSC与SSC散点图中圈选活的单个淋巴细胞群作为P1门。采用同型对照和单阳性对照进行补偿调节。使用四组双色荧光标记抗体染色以分析表面标志物的表达。抗HLA-DR和抗CD19抗体用于检测B细胞，抗CD3、抗CD4和抗CD8抗体用于检测T细胞。抗CD16和抗CD56抗体用于鉴定NK细胞。（A） L196表型为CD19

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人 HLA-DR FITC	BD	560944	FACS 用抗体
人 CD4 FITC	BD	555346	FACS 用抗体
人/非人灵长类 CD8 PE	BD	557086	FACS 用抗体
人 CD3 PE	BD	555340	FACS 用抗体
人 CD16 FITC 3G8	BD	555406	FACS 用抗体
人/非人灵长类 CD56 PE MY31	BD	556647	FACS 用抗体
人 CD19 PE-Cy7	BD	560728	FACS 用抗体
人 IL-2	Roche	11147528001
人血清	MRC	CCC118-125
离心机	Techcomp	CT6T	用于离心
自动细胞计数仪	Countstar	IC 1000	用于细胞计数
24 孔细胞培养板	Corning Incorporated	3524	聚苯乙烯板
25 cm² 细胞培养瓶	Nest	707001	聚苯乙烯
FBS	Gibco	10270	细胞培养基组分
RPMI 1640 培养基	life	22400089	用于配制细胞培养基
L-谷氨酰胺	Amresco	374	细胞培养基组分
100 倍链霉素-青霉素溶液 BioRoYeeBRY-2309	BioRoYee	BRY-2309	细胞培养基组分
流式细胞仪	BD	BD FACSAria II
软件	BD	BD FACSDiva 软件	用于 FACS 分析