基于噬斑实验的感染小鼠组织样本中病毒载量定量分析

摘要

来源：Morales Vasquez, D.，等．利用报告基因表达的重组SARS-CoV-2对K18 hACE2转基因小鼠进行活体成像与病毒感染定量分析．视频实验杂志（2021）

本视频演示了基于噬斑实验的病毒滴定方案，用于定量检测从病毒感染小鼠模型中采集的组织样本中的感染性病毒水平。

方案

所有涉及动物样本的操作均经相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 病毒滴定
   1. 利用组织匀浆上清液，进行10倍系列稀释，并用每种稀释度的上清液1 mL感染汇合的Vero E6细胞单层（6孔板格式，1.2 × 10⁶ 细胞/孔，设三个重复
   2. 在37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中孵育1小时，使病毒吸附。
   3. 病毒吸附后，用1 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，随后在含1%琼脂的2 mL感染后培养基中，于37 °C、5% CO₂恒湿培养箱中孵育72 h。
   4. 孵育后，将培养板置于4 °C条件下，用10%中性缓冲甲醛溶液灭活24小时，确保整个培养板完全浸没。
   5. 从生物安全三级（BSL3）柜中取出培养板，用1 mL 1×PBS洗涤细胞3次，并在室温（RT）下用1 mL 0.5% Triton X-100孵育10分钟以进行透化处理。
   6. 用1 mL含2.5%牛血清白蛋白（BSA）的1x PBS于37 °C封闭细胞1 h，随后在1 mL用2.5% BSA稀释的1 µg/mL SARS-CoV核衣壳（N）蛋白交叉反应性单克隆抗体（1C7C7）中于37 °C孵育1 h。
   7. 用 1 mL 的 1× PBS 洗涤细胞三次，并使用 Avidin-biotin 复合物（ABC）试剂盒显色斑块 3,3′-二氨基联苯胺（DAB）过氧化物酶底物试剂盒，按照制造商说明书操作。
   8. 以噬斑形成单位（PFU/mL）计算病毒滴度。
      注意： 使用公式 PFU/mL = 稀释倍数 × 空斑数 × (1 mL/接种体积) 进行计算。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5% Triton X-100	J.T.Baker	X198-07	室温（RT）保存
10% 中性缓冲福尔马林溶液	Sigma-Aldrich	HT501128
琼脂	Oxoid	LP0028
6孔细胞培养板	Greiner Bio-one	657160
非洲绿猴肾上皮细胞（Vero E6）	ATCC	CRL-1586
牛血清白蛋白（BSA），35%	Sigma-Aldrich	A9647	4 °C 保存
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Corning Cellgro	15-013-CV	4 °C 保存
VECTASTAIN ABC-HRP 试剂盒，过氧化物酶	Vector Laboratories	PK-4002	ABC 试剂盒和 DAB 过氧化物酶底物试剂盒