逆转录酶活性作为类病毒颗粒产生的标志物

摘要

来源： Scarborough, R. J., et al. 针对HIV-1产生的RNA在基因或药物治疗中应用的疗效与毒性评估。 J. Vis. Exp. (2016)。

本视频演示了一种逆转录酶（RT）检测方法，用于评估待测RNA对病毒样颗粒（VLP）产生的影响。将细胞共转染质粒后，通过测量RT活性来定量反映VLP的产量。RT活性的降低表明待测RNA抑制了病毒基因的表达。

方案

1. 病毒产生检测

1. 从培养箱中取出24孔细胞培养板，在生物安全三级（BSL3）细胞培养罩内轻轻摇晃。从每个孔中转移150 µl上清液至96孔平底板中对应的孔内，用于定量检测HIV-1的产生。

注意：常用的病毒定量检测方法包括通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测人免疫缺陷病毒（HIV）-1 衣壳蛋白（p24）的表达、通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）对病毒RNA进行定量，以及检测HIV-1逆转录酶（RT）的活性。步骤1.2至1.5介绍了定量检测HIV-1 RT活性的方法。

2. 取5 µl上清液转移至96孔板中对应的孔内，孔中预先加入25 µl病毒裂解液混合物（表1）。室温（RT）孵育5分钟，然后将板转移至放射性工作站。

注意：仅当BSL3实验室中没有放射性工作站时，才需要执行步骤1.2。如果培养板无需移出BSL3实验室，则直接进行步骤1.3，并加入50 µl放射性/病毒裂解液（表1），以替代25 µl的放射性裂解液。

3. 配制放射性混合液 (表 1)，并向每孔病毒上清液和裂解混合液中各加入 25 µl。将培养板在 37 °C 下孵育 2 小时。
4. 取 5 µl 反应混合液点样于玻璃纤维二乙氨基乙基（DEAE）滤膜纸的相应方格中，让点样斑点干燥 10 分钟。将反应混合液点样在每隔一个的方格中，确保任意两个样品之间不直接相邻。这有助于在步骤 1.6 中测定每分钟计数（cpm）时避免样品间的交叉干扰。
5. 用 2× 柠檬酸钠-氯化钠（SSC）缓冲液 (表 1) 将滤膜纸洗涤 5 次，每次 5 分钟，随后用 95% 乙醇洗涤 2 次，每次 1 分钟。让滤膜纸自然干燥，并将其密封于样品袋中。
6. 将装有滤膜纸的样品袋夹入样品盒中，并将样品盒插入微孔板闪烁计数器。设置计数器以检测实验所用批次 [³²P]脱氧胸苷三磷酸（dTTP）提供的参考日期对应的放射性磷同位素（³²P）的每分钟计数（cpm）。根据板图选择需读取的样品，并启动计数器。
7. 对于任何病毒定量方法，将每个测试 RNA 所得数值除以其相邻的阴性对照值，再将该结果乘以 100，得到每份测试 RNA 重复样本对 HIV-1 产生的抑制百分比。不同浓度下不同测试 RNA 的结果比较示例见 图 1。

表1： 非商业化缓冲液和试剂的组分。所有非商业化缓冲液和试剂的配方均已提供。

缓冲液/试剂名称	成分
病毒裂解液混合物	60 mM Tris-HCl（来自1 M Tris-HCl，pH 7.8），75 mM KCl，5 mM MgCl2，1.04 mM EDTA，1% NP-40。
放射性混合物	60 mM Tris-HCl（来自1 M Tris-HCl，pH 7.8），75 mM KCl，5 mM MgCl2，1.04 mM EDTA，10 µg/ml Poly(A)，0.33 µg/ml oligo dT。使用前立即加入：每500 µl混合物中加入8 mM二硫苏糖醇（DTT, C4H10O2S2）和5 µl [32P] dTTP（3,000 Ci/mmol）。
放射性/病毒裂解液混合物	60 mM Tris-HCl（来自1 M Tris-HCl，pH 7.8），75 mM KCl，5 mM MgCl2，1.04 mM EDTA，0.1% NP-40，5 µg/ml Poly(A)，0.16 µg/ml oligo dT。使用前立即加入：每1 ml混合物中加入8 mM二硫苏糖醇（DTT, C4H10O2S2）和5 µl [32P] dTTP（3,000 Ci/mmol）。
2x SSC	7.53 g NaCl 和 8.82 g 柠檬酸钠-2H2O 溶于 1 L H2O 中。

结果

图1：测试siRNA对HIV-1产生的影响。（A）不同长度和对称性的siRNA设计。利用HIV-1 RNA中的一个保守序列（1498靶位点）设计了具有不同长度（17至29个核苷酸的有义链）的对称性和非对称性siRNA（si1498-）。图中显示了预期的有义链（上方，黑色）和反义链（下方，红色）。（B）si1498长度变异体对HIV-1产生的抑制作用。相对于长Dicer底物无义siRNA（siNS），转染了对称或非对称si1498长度变异体的HEK293T细胞上清液中HIV-1逆转录...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养板，96 孔，24 孔，6 孔。	Corning	353075, 353047, 353043
[³²P]dTTP	Perkin Elmer	BLU505H
poly(A) RNA 模板	Sigma-Aldrich	10108626001
寡聚(dT)12-18 DNA 引物	Thermo Fisher	18418-012
DEAE 滤膜纸	Perkin Elmer	1450-522
微孔板闪烁计数器	Perkin Elmer	1450-024
裂解缓冲液片剂	Roche	4693159001, 4906837001	蛋白酶和磷酸酶抑制剂