免疫染色法用于可视化昆虫肠道中病毒抗原与宿主蛋白的共定位

摘要

来源：Zhang, L., 等．半翅目昆虫肠道中植物病毒与昆虫媒介蛋白的免疫荧光标记．J. Vis. Exp. (2021)

该视频展示了为荧光成像而制备感染植物病毒的昆虫介体肠道组织的过程。固定后的肠道组织经洗涤、通透化处理后，在封闭溶液中与两种荧光标记抗体共同孵育——一种针对囊泡中的病毒抗原，另一种针对囊泡相关膜蛋白。组织经肌动蛋白纤维反染，并用含核染料的封片剂封片后进行成像，以揭示病毒蛋白与宿主蛋白在原位的共定位情况。

方案

1. 非传毒昆虫的饲养

1. 从稻田中采集白背飞虱（WBPHs），用1升玻璃烧杯饲养，并以防虫网覆盖，在28 °C、16小时光照和8小时黑暗的培养箱中用稻苗饲喂。由于南方水稻黑条矮缩病毒（SRBSDV）不通过卵传播，新孵化的若虫不带毒。
2. 使用毛笔轻轻将昆虫从烧杯中刷出，每周将饲养的昆虫转移至装有新鲜稻苗的新烧杯中，直至白背飞虱若虫孵化。继续饲养这些孵化出的无毒若虫至2龄或3龄。
   注意： 刷虫时应小心操作，避免白背飞虱从烧杯中飞出或造成损伤。

2. 病毒获取及带毒昆虫的收集

1. 将非带毒昆虫从玻璃烧杯转移到覆盖有防虫网的SRBSDV感病水稻植株上，通过取食进行为期2天的病毒获毒获取期（AAP）。随后，将昆虫收集到含有新鲜水稻幼苗的玻璃烧杯中。
2. 2天后，使用手动吸虫器从玻璃烧杯中收集昆虫，用于解剖并切除肠道。
   注意： SRBSDV在WBPH若虫和成虫中的最短获毒获取期为5分钟，但为了达到高达80%的获毒效率，应让昆虫在新鲜的SRBSDV感病水稻植株上取食2天。

3. 试剂配制

1. 将8.5 g氯化钠（NaCl）、3.5 g十二水合磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·12H₂O）和0.25 g磷酸二氢钠（NaH₂PO₄）溶解于1 L双蒸水（ddH₂O）中，配制0.01 M磷酸盐缓冲液（PBS）。
2. 将4 g多聚甲醛加入100 mL PBS中，配制4%（m/v）多聚甲醛PBS溶液。
3. 将2 mL Triton X-100加入98 mL PBS中，配制2%（v/v）Triton X-100溶液。

4. 成虫解剖与肠道切除

1. 使用移液器将100 µL PBS置于载玻片上。将载玻片放置于光学显微镜的载物台上。
2. 从玻璃烧杯中用人工吸虫器收集感染SRBSDV的成虫，并将其放入1.5 mL离心管中。将离心管置于冰上使昆虫麻痹，然后将一只麻痹的成虫转移至载玻片上含有100 µL PBS的液滴中，使腹部朝上。
   注意： 昆虫在冰上放置5分钟后将完全麻痹。
3. 一手用镊子夹住身体，另一手用另一把镊子去除头部。
4. 用一组镊子夹住腹部两侧，用另一组镊子夹住尾部的产卵器或交配器官。然后，小心缓慢地拉开一个腹节的节间膜，暴露腹部内的肠道。
5. 继续撕去膜组织，逐渐将完整的肠道从腹部拉出。轻柔地拉掉与肠道末端相连的尾部，以取出完整的肠道。
   注意： 非常小心地牵拉，否则肠道会被损伤。
6. 将切除的肠道放入一个200 µL离心管中，加入200 µL PBS，用移液器轻轻吸打溶液，充分清洗肠道。

5. 若虫解剖与肠道切除

注意：若虫的身体比成虫更脆弱，从尾部拉取时肠道容易受损。因此，切除若虫肠道最可靠的方法是从头部进行拉取。

1. 使用移液器将 100 µL PBS 滴加到玻璃载玻片上。将载玻片置于光学显微镜的载物台上。
2. 使用手动吸虫器从玻璃烧杯中收集感染 SRBSDV 的若虫，并将其放入 1.5 mL 离心管中。将离心管置于冰上以麻痹昆虫。然后将一只麻痹的若虫转移至载玻片上的 100 µL 缓冲液中，使腹部朝上。
3. 使用镊子剪除若虫的尾部。随后用一对镊子夹住虫体以轻柔固定，再用另一对镊子夹住头部。在保持头部与肠道连接的前提下，轻柔地将头从身体上拉开，使头部与身体分离，但肠道仍附着于胸部和腹部。
   注意： 头部脱落后，若虫的脂肪体将流出，导致 PBS 变浑浊。应移除浑浊的 PBS 溶液，并更换为 100 µL 新鲜 PBS。
4. 在继续用镊子夹住虫体的同时，使用另一对镊子小心移动头部，并逐步将肠道拉出。
5. 用镊子将肠道从头部轻柔分离，最终获得一个完整的肠道，且不损伤飞虱虫体。
6. 将分离的肠道放入 200 µL 离心管中，向管中加入 200 µL PBS，并用移液器轻轻吹吸溶液，以充分清洗肠道。
   注意： 分离的肠道应使用 PBS 充分清洗，以去除腹腔中可能污染的脂肪组织；这些组织可能干扰染色实验流程。

SRBSDV 病毒粒子和一种昆虫蛋白的标记方案

1. 准备本实验所用的抗体和封片介质。抗体包括：用Dylight 549（红色）标记的抗SRBSDV抗体（针对SRBSDV病毒粒子）、用Dylight 488（绿色）标记的抗VAMP7抗体（针对昆虫蛋白囊泡相关膜蛋白7，VAMP7）、Dylight 633鬼笔环肽（蓝色），以及含有4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，蓝色）的封片介质。
2. 将新解剖并用PBS洗涤过的WBPH肠道立即放入含有100 µL 4%（m/v）多聚甲醛的200 µL离心管中，室温固定2小时。
   注意：新解剖的WBPH肠道不应在PBS中浸泡过久，否则上皮细胞将受损。
3. 用移液器吸除4%（m/v）多聚甲醛，然后向200 µL离心管中加入200 µL PBS。10分钟后，用移液器吸除PBS以彻底清除残留的多聚甲醛。
4. 重复此PBS洗涤步骤两次。
5. 吸除PBS，加入200 µL非离子型去垢剂Triton X-100（2%，v/v）。在室温下用非离子型去垢剂对样品进行30分钟的通透处理。
6. 用移液器吸除2%（v/v）Triton X-100，然后用200 µL PBS进行三次、每次10分钟的洗涤，以去除残留去垢剂（参见步骤6.3和6.4）。
7. 用50 µL牛血清白蛋白（3%，m/v）将Dylight 549（红色）标记的抗SRBSDV抗体和Dylight 488（绿色）标记的抗VAMP7抗体按1:50比例稀释。
8. 将稀释后的抗体加入离心管中，于4 °C孵育过夜。
9. 用移液器吸除抗体稀释液，然后用200 µL PBS进行三次、每次10分钟的洗涤，以去除残留的抗体稀释液。
10. 将1 µL Dylight 633鬼笔环肽用50 µL PBS稀释。
11. 向离心管中加入50 µL稀释后的鬼笔环肽，室温孵育2小时。
12. 用移液器吸除鬼笔环肽稀释液，然后用200 µL PBS进行三次、每次10分钟的洗涤，以去除残留的鬼笔环肽。
    注意：充分洗涤对于降低背景信号和非特异性结合至关重要。
13. 在载玻片上滴加一滴含DAPI的封片介质，将肠道转移至介质中。
    注意：用镊子轻轻展开每一段肠道，避免产生气泡。每张载玻片约放置15个肠道。
14. 轻轻盖上盖玻片，避免产生气泡。
    注意：载玻片应在4 °C避光保存，以防止荧光淬灭，待激光共聚焦显微镜观察前使用。
15. 使用激光共聚焦显微镜观察所有样品。用蓝光激发采集图像，并将文件保存至计算机。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3% 牛血清白蛋白（BSA）	Coolaber	SL1331	用于稀释抗体
盖玻片	Solarbio	YA0771-18*18mm	用于制片
体视显微镜	Beitja	XTL-7045B1	用于昆虫解剖
激光扫描共聚焦显微镜	Zeiss	Zeiss LSM880	观察荧光信号
载玻片	Solarbio	ZBP-7105	用于制片
含4'6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂	Abcam	AB104139	标记细胞核
多聚甲醛	Sigma	158127	用于组织固定
鬼笔环肽	Invitrogen	A22284	标记中肠上皮细胞的肌动蛋白
吐温X-100	Amresco	0290C484	用于组织通透
镊子（5-SA）	AsOne	6-7905-40	用于昆虫解剖