从受精鸡胚中扩增与收获流感病毒

摘要

来源：Brauer, R. et al.，鸡胚中流感病毒的增殖。J. Vis. Exp. (2015)

本视频展示了在受精鸡胚中合成和收获流感病毒的过程。将病毒接种至尿囊腔，在上皮细胞中复制，并出芽进入尿囊液，随后收集并储存尿囊液用于后续应用。

方案

1. 通过尿囊途径接种流感病毒
   1. 在病毒接种当天（第10或11天），再次对鸡蛋进行照检，并剔除任何已死亡的胚胎。通过观察蛋内是否有活动来判断胚胎是否存活。
   2. 从培养箱中取出三个鸡蛋，并将其放置在独立的蛋架上，气室朝上。
   3. 用永久性记号笔标记鸡蛋的气室位置。
   4. 用70%乙醇清洗气室上方的蛋壳表面。
   5. 将气室朝上的鸡蛋放入蛋托中，然后置于生物安全柜（生物安全二级或BSL-2）内。
   6. 使用无菌的18号针头在每个鸡蛋气室上方的蛋壳上穿刺一个小孔。注意不要将针头插入过深，以免刺伤胚胎或卵黄。
   7. 用无菌的1 ml注射器吸取稀释后的流感病毒，并安装22号针头。
   8. 以45°角小心地将带针头的注射器插入尿囊腔。
   9. 注入0.2 ml稀释后的流感病毒。
   10. 对另外两个鸡蛋重复上述注射操作，然后丢弃注射器和针头。
   11. 用热熔胶枪的一滴胶（或熔化的石蜡）封住小孔。注意避免胶液渗入蛋内。
   12. 将鸡蛋重新放回孵化箱中，保持气室朝上。
   13. 重复步骤1.2 – 1.12，直至所有鸡蛋均完成接种。
2. 培养时间
   1. 将感染的鸡蛋在37 °C、约60%湿度条件下静置培养，不翻蛋。
   2. 根据流感病毒类型选择最佳培养时间：甲型流感病毒培养48小时；乙型和丙型流感病毒培养72小时。
3. 流感病毒收获
   1. 培养结束后，将鸡蛋在4 °C下冷藏至少4小时（或过夜），以杀死胚胎并收缩血管，减少血液污染感染性尿囊液的风险。此步骤可防止红细胞吸附病毒，从而降低病毒产量。也可选择在-20 °C下冷藏30分钟；但此方法会增加血液污染的风险。
   2. 待鸡蛋充分冷却后，将其转移至生物安全柜中。将鸡蛋放入固定蛋架，气室朝上。用70%乙醇清洁蛋壳表面。
   3. 使用无菌剪刀剪开气室上方的蛋壳。小心去除气室周围的蛋壳，避免破坏尿囊绒毛膜。
   4. 用无菌钝头镊子打开尿囊绒毛膜。用小刮勺或小勺轻轻移开胚胎和卵黄囊，注意不要弄破卵黄。
   5. 使用1 ml Eppendorf移液器小心收集尿囊液。如有需要，可将鸡蛋略微倾斜，以便尽可能多地收集液体。
   6. 将所有鸡蛋的尿囊液合并至一个50 ml塑料锥形管中。在病毒收获过程中，始终将管子置于冰上。每个鸡蛋可收获5 – 10 ml淡黄色液体。
   7. 将含有病毒的尿囊液在4 °C下以1,000 x g离心10分钟，以沉淀杂质。将上清液转移至另一个预冷的50 ml管中，继续置于冰上。将废弃鸡蛋放入BSL-2级废弃物容器中处理。
4. 储存
   1. 立即对澄清的尿囊液进行分装（例如50、100或500 µl/份），并在液氮中速冻。将冻存的病毒储备液转移至-80 °C冰箱中长期保存。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无特定病原体（SPF）受精鸡胚	VALO BioMedia
加湿型孵蛋器	FARM iNNOVATORS	Model 2100
自动翻蛋器	FARM iNNOVATORS	Model 3200
照蛋仪	FARM iNNOVATORS	Model 3300
1 ml 注射器	BD Bioscience	309659
18G 针头	BD Bioscience	305196
乙醇>99.5%	Sigma-Aldrich	459844	用水稀释至70%
热熔胶枪 "Ad tech Hi Temp Project Pro"	Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.	Model 1105
胶棒 "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp"	Ad tech, Adhesive Technologies, Inc.	220-34ZIP30