在哺乳动物细胞中增殖与收获溶瘤单纯疱疹病毒

摘要

来源：Nguyen, H., 等. 溶瘤单纯疱疹病毒的培养、纯化与滴定.J. Vis. Exp. (2021).

本视频展示了溶瘤性单纯疱疹病毒在哺乳动物细胞培养中的扩增与收获过程，重点呈现了病毒进入细胞、复制以及病毒负载细胞的回收。此外，还演示了保存感染细胞以用于后续处理的方法。

方案

1. 溶瘤单纯疱疹病毒（oHSV）的培养

注意：在使用oHSV之前，须确保获得机构生物安全委员会的批准。本研究是在已获批准的IBC方案编号18007下进行的。须保持BSL2级防护措施：所有接触过病毒的移液管、枪头、试管及其他材料均需用漂白剂处理。在手离开BSL2级细胞培养操作台之前，须用70%异丙醇喷洒手套。每次操作病毒后，务必用肥皂水彻底清洗双手。

1. 在第 -1 天，将低传代 Vero 细胞接种于 20 个 T-150 cm² 培养瓶中² 密度为 7-8 × 10 的培养瓶⁶ 细胞/瓶中的常规Vero细胞培养基
   注意： Vero 培养基通过在 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中添加 10% 热灭活胎牛血清（IFCS）制备而成。
2. 第0天（细胞融合度为80-90%时），将oHSV接种物加入Vero细胞中。
   1. 病毒接种液的制备
      1. 使用感染复数（MOI）为 0.01（MOI 可根据病毒的复制能力在 0.01 至 0.1 之间调整）进行病毒扩增。使用以下公式计算 20 个培养瓶所需的病毒量（mL）。 20 个培养瓶所需病毒量（mL） = 所需病毒量（pfu）/病毒原液滴度（pfu/mL）。
      2. 使用含1% IFCS的高糖 Dulbecco 磷酸盐缓冲液（DPBS）配制病毒接种液（每T-150 cm²培养瓶7 mL）² 烧瓶，即 20 个烧瓶共需约 140 mL）。将所需量的 oHSV 加入 140 mL 高糖 DPBS/1% IFCS 溶液中，涡旋混匀 1 分钟，并将混合液置于一旁备用，以便后续加入 Vero 细胞中。
   2. 洗涤 T-150 cm 培养瓶² 吸弃上清液，用含1% IFCS的高糖DPBS洗涤2次（10 mL/次）。吸除DPBS/1% IFCS，每瓶T-150 cm²培养瓶加入7 mL病毒接种液。² 烧瓶
   3. 轻轻摇动锥形瓶5分钟，使用锥形瓶摇床使接种物在Vero单层细胞上均匀分布，然后将锥形瓶置于37 °C培养箱中孵育1.5–2小时。确保培养箱内的架子处于水平状态。
   4. 移除接种物，加入含1% IFCS的DMEM（25 mL/瓶）。将培养瓶孵育2-4天。
3. 每天检查培养瓶，观察是否出现90-100%细胞病变效应（CPE）（参见 图1).
4. 收获感染oHSV的Vero细胞。
   1. 从每个锥形瓶中收集培养上清液（约 20 mL），留约 5 mL 在瓶中，收集至 50 mL 圆锥形离心管或培养基容器中。
   2. 使用细胞刮轻轻刮取培养瓶底部的细胞。
      注意： 细胞应迅速从培养瓶上脱落。
   3. 向每个烧瓶中加入约 15 mL 培养上清液（步骤 1.4.1 中收集），使每瓶总体积约为 20 mL（即 20 个烧瓶共 400 mL），然后用 10 mL 无菌刻度吸管轻轻吹洗烧瓶底部数次。
      注意： 做 不 用力吹打。目标是保持所有细胞完整。
   4. 将细胞（连同培养基）收集到预冷的50 mL锥形离心管中，置于冰上（使用8个离心管分装从20个培养瓶中收获的400 mL细胞悬液）。
   5. 300 × g 离心细胞 g 4 °C 条件下离心 10 分钟，吸除上清液。
   6. 向每支离心管中加入1.25 mL（50%）病毒缓冲液（VB）和1.25 mL（50%）培养上清液（步骤1.4.1中收集），充分重悬每支管中的沉淀。将八支50 mL离心管中的重悬细胞转移至一支50 mL锥形离心管中。
      注意： 参考VB溶液的制备方法 表1使用培养基除菌滤器对VB溶液进行过滤除菌。每T-150 cm²培养瓶使用0.5 mL VB溶液与0.5 mL上清液混合² 用于重悬的烧瓶，例如，20 个烧瓶（20 mL），使用 10 mL VB 和 10 mL 培养上清液。
   7. 使用干冰/100% 乙醇对重悬的细胞进行速冻，并于 -80 °C 保存。

表1：溶液成分

溶液组成
病毒缓冲液的配制	用量
1 M 氯化钠	15 mL
1 M 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-盐酸）	3 mL
纯化水	132 mL
	调pH至6.8
X-gal溶液的配制（约6.5 mL/一块6孔板）
250 mM 铁氰化钾	130 µL
250 mM 亚铁氰化钾	130 µL
1 M 氯化镁	13 µL
X-gal（20 mg/mL，预先溶于二甲基亚砜DMSO中）	162.5 µL
磷酸盐缓冲液（PBS）	6064.5 µL
中性红溶液的配制（每块6孔板）
中性红溶液	100 µL
甲醇	1 mL
纯化水	7 mL

结果

图1：oHSV感染后Vero细胞中的细胞病变效应。 Vero细胞接种编码mCherry（显示为红色荧光）的oHSV，感染复数（MOI）为0.01，在病毒感染后36、48和72小时进行成像（10倍放大）。细胞病变效应（CPE）表现为oHSV感染细胞的变圆（黑色箭头指示）。比例尺 = 200 μm。缩写：oHSV = 溶瘤性单纯疱疹病毒。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.7 mL 离心管	Sigma	CLS3620
15 mL 聚丙烯离心管	Falcon	352097
5 mL 聚丙烯管	Falcon	352063
50 mL 聚丙烯离心管	Falcon	352098
细胞刮刀	Fisher Scientific	179693
二甲基亚砜	Sigma	D2650-100ML
杜尔贝科改良伊格尔培养基	Corning	MT-10-013-CV
杜尔贝科磷酸盐缓冲液	Corning	MT-21-031-CV
胎牛血清	Hyclone	SH3007003
高糖杜尔贝科磷酸盐缓冲液	Sigma	D4031
板式摇床	Fisher	88861043
Sorvall ST 16R 离心机	ThermoFisher Scientific	75004381
Sorvall ST 21R 离心机	ThermoFisher Scientific	75002446
带螺口盖的无菌微量离心管	Fisher Scientific	02-681-371
蔗糖	Fisher Scientific	BP220-1
T150 培养瓶	Falcon	355001