来源：Nguyen, H., et al. 溶瘤单纯疱疹病毒的培养、纯化与滴定。 J. Vis. Exp. (2021)
本视频展示了利用核酸酶处理、连续离心、膜过滤和蔗糖垫层离心法，从感染的哺乳动物细胞培养物中纯化溶瘤病毒的过程。
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方法文章
从感染的哺乳动物细胞中纯化溶瘤病毒
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2026年7月31日
本文内容
摘要
方案
1. 溶瘤单纯疱疹病毒（oHSV）纯化
- 将细胞在37 °C水浴中解冻，随后进行水浴超声处理，每次1分钟，共3个循环，以确保细胞充分裂解，使病毒释放至上清液中。
注意：使用40 kHz、120 V功率进行1分钟超声处理。若无可调式超声仪，可使用超声水浴仪。取50 μL样品用于滴定，以帮助确定纯化过程中可能导致病毒损失的具体步骤。 - 用Benzonase核酸酶（175单位/mL）和2 mM氯化镁（MgCl2）（1 M储存液 = 2 µL/mL）处理细胞裂解物，涡旋混匀后于37 °C孵育30分钟。将管子置于冰上，并在4 °C下进行后续操作。
- 通过低速离心沉淀细胞碎片。
- 以300 g离心10分钟。
- 将上清液转移至新的50 mL锥形离心管中（将细胞沉淀用0.5 mL病毒缓冲液（VB）重悬，标记为沉淀-1，4 °C保存，用于步骤1.3.5；见图1）。
- 将上清液（来自步骤1.3.2）再次以500 g离心10分钟。
- 将上清液转移至新的50 mL锥形离心管中（将细胞沉淀用0.5 mL VB重悬，标记为沉淀-2，4 °C保存，用于步骤1.3.5；见图1）。
- 将重悬的沉淀-1（来自1.3.2）和沉淀-2（来自1.3.4）合并至新的1.7 mL离心管中，涡旋或水浴超声处理2次，然后以400 g离心10分钟。收集上清液，并与步骤1.3.4获得的上清液合并；见图1。
注意：使用40 kHz、120 V功率进行1分钟超声处理，以防止在步骤1.4的过滤前发生病毒聚集。取50 μL合并后的上清液用于滴定。
- 采用以下三步过滤法对合并后的上清液进行过滤。
- 使用10 mL注射器吸取21 mL上清液（每次5–7 mL，便于顺利通过滤膜），将其通过置于新50 mL锥形离心管（标记为管1）上的无菌5 μm聚偏二氟乙烯（PVDF）膜滤器。
- 向步骤1.4.1中已清空的50 mL锥形离心管中加入1 mL VB，涡旋混匀，再通过置于管1上的同一5 μm PVDF滤器（使滤液体积总计达22 mL）。进入步骤1.4.2。
- 从管1中吸取22 mL滤液（如步骤1.4.1所述），将其通过置于新50 mL锥形离心管（标记为管2）上的无菌0.8 μm混合纤维素酯（MCE）膜滤器。
- 向步骤1.4.2中已清空的管1中加入1 mL VB，涡旋混匀，再通过置于管2上的同一0.8 μm MCE滤器（使滤液体积总计达23 mL）。进入步骤1.4.3。
- 从管2中吸取23 mL滤液（如步骤1.4.1所述），将其通过置于新50 mL锥形离心管（标记为管3）上的无菌0.45 µm PVDF滤器。
- 向步骤1.4.3中已清空的管2中加入1 mL VB，涡旋混匀，再通过置于管3上的同一0.45 μm PVDF滤器（使滤液体积总计达24 mL）。
注意：取50 μL滤液用于滴定。
- 向步骤1.4.3中已清空的管2中加入1 mL VB，涡旋混匀，再通过置于管3上的同一0.45 μm PVDF滤器（使滤液体积总计达24 mL）。
- 使用10 mL注射器吸取21 mL上清液（每次5–7 mL，便于顺利通过滤膜），将其通过置于新50 mL锥形离心管（标记为管1）上的无菌5 μm聚偏二氟乙烯（PVDF）膜滤器。
- 采用蔗糖梯度法进行高速离心
注意：本方案使用固定角转子F13-14x50cy。转子和离心机在进行以下步骤前必须预冷至4 °C。- 在新的50 mL锥形离心管中加入10 mL冰浴、无菌过滤的25%蔗糖溶液（将25 g蔗糖粉末溶于100 mL Hank's平衡盐溶液中制备）。
- 缓慢（3 mL/min）将24 mL病毒滤液（来自步骤1.4.3.1）加至蔗糖层上方，注意保持病毒滤液与蔗糖溶液的分层。
注意：最多可在10 mL蔗糖溶液上加入30 mL病毒层。 - 在4 °C下以22,620 g离心90分钟。
- 从50 mL锥形离心管中移除上清液和蔗糖层。
注意：病毒沉淀应呈乳白色。分别取50 μL上清液和50 μL蔗糖层用于滴定。
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结果
图1：oHSV增殖、纯化及空斑实验主要步骤的示意图。 缩写：oHSV = 溶瘤性单纯疱疹病毒；CPE = 细胞病变效应；VB = 病毒缓冲液；HBSS = 亨克氏平衡盐溶液；PBS = 磷酸盐缓冲液。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.7 mL 离心管 | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL 聚丙烯离心管 | Falcon | 352097 | |
| 50 mL 聚丙烯离心管 | Falcon | 352098 | |
| Benzonase 核酸酶 | Sigma | E8263-25KU | |
| 甘油 | Sigma | G5516 | |
| 氯化镁 | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Sorvall ST 16R 离心机 | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R 离心机 | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| 蔗糖 | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| 注射器滤器，0.45 µm PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| 注射器滤器，0.8 µm MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| 注射器滤器，5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| 超声波水浴 | Branson | CPX-952-116R |
