基于荧光的重组痘苗病毒检测与纯化

摘要

来源：Yuan, M., 等．构建突变型痘苗病毒载体的一种简单高效方法．J. Vis. Exp. (2016)

本视频演示了使用编码红色荧光蛋白（RFP）的重组痘苗病毒在成纤维细胞中进行荧光蚀斑试验的操作过程，随后进行蚀斑的分离与纯化，以用于进一步分析。

方案

1. 修饰型痘苗病毒（VV）的纯化（第一轮）
   1. 第1天，将15个6孔板每孔接种3 × 10⁵个CV-1细胞。
      1. 第2天，在37 °C水浴中解冻冷冻的细胞悬液3分钟，然后剧烈涡旋震荡冻存管30秒，以获得含有细胞碎片的细胞裂解液。
2. 感染一板6孔板中的CV-1细胞时，将1 µL细胞裂解液用3 mL杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）稀释，然后取0.5 mL稀释后的细胞裂解液加入6孔板的每孔中，加至原有培养基上方。对所有准备好的6孔板进行感染。
   注意： 无需去除细胞碎片。
3. 感染两天后（即， 在第4天，使用10倍物镜在荧光显微镜下识别红色荧光蛋白（RFP）阳性的斑块，并用记号笔在培养板底部标记斑块位置，圈出斑块所在区域。
   注意： 参见 图1 代表性RFP阳性斑块。
   1. 准备六个已标记的冻存管，每管中加入200 µL无血清DMEM细胞培养基，用于挑取六个不同的RFP阳性噬斑。吸除含有标记噬斑的孔中的细胞培养液。将200 µL吸头安装到P200移液器上，设定体积为30 µL，从一个冻存管中吸取约10 µL细胞培养基。
   2. 握住移液器按钮，不要松开液体，用枪头刮取一个已标记噬斑区域的细胞。松开移液器按钮，将脱离的细胞吸起，并转移至含有190 µL无血清DMEM的冻存管中。
   3. 从含有刮取细胞的离心管中再吸取10 µL培养基，重复三次吸取同一RFP阳性菌斑的操作，以尽可能收集更多的刮取细胞。将所有收集的细胞转移至同一离心管中，并将离心管置于-80 °C保存。
      注意： 或者，如果立即进行第二轮纯化，可将冻存管置于干冰中冷冻10分钟。

结果

图1：突变病毒第一轮纯化中的RFP阳性噬斑。 在突变病毒的第一轮纯化过程中，具有目标区域缺失的RFP阳性噬斑（以红线圈出）被野生型病毒形成的噬斑（以黄线圈出）所包围。A：相差显微图像（原始放大倍数100X）。B：荧光显微图像（原始放大倍数100X）。比例尺 = 50 µm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
质粒编号 41824	41824	Addgene	gRNA 克隆载体
pST1374	13426	Addgene	Cas9 克隆载体
pGEMT easy	A1360	promega	修复供体质粒克隆
One Shot TOP10 化学感受态大肠杆菌	C4040-10	Invitrogen	转化
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒	27106	Qiagen	质粒提取
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	11965-092	Life Technologies	细胞培养基
胎牛血清（FBS）	SH30088.03HI	Hyclone	细胞培养血清
青霉素、链霉素	15070-063	Thermo Scientific	抗生素
Effectene	301425	Qiagen	转染
Thermo Scientific Nalgene 冻存管；2.0 mL	W-06754-96	Thermo Scientific	收集病毒