一种用于测量病毒株相对复制适合度的检测方法

摘要

来源：Manocheewa, S., 等. 用于确定人类免疫缺陷病毒复制适合度的成对生长竞争实验。 J. Vis. Exp. (2015)

该视频演示了通过比较两种病毒株在人类免疫细胞中的复制情况，来测定其相对复制适合度的增长竞争实验步骤。

方案

1. 嵌合型 HIV-1 NL4-3 分子克隆的构建

1. 扩增插入DNA片段
   1. 设计嵌合引物。正向和反向引物的5’端均包含HIV-1载体序列，该序列即为插入片段的插入位点。引物的3’端必须包含插入序列的末端（图1）。确保嵌合引物序列保持原有的开放阅读框。
      1. 引物长度至少为20个碱基，熔解温度大于或等于60 °C，GC含量约为50%，且形成引物二聚体、异源二聚体和/或发夹结构的倾向较低。使用OligoAnalyzer在线工具（https://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/）评估这些特性。
   2. 使用聚合酶链式反应（PCR）和嵌合引物扩增插入DNA（图1）。每个PCR反应体系包含：1×高保真缓冲液、0.2 mM dNTPs、1 U高保真DNA聚合酶、0.5 µM正向嵌合引物、0.5 µM反向嵌合引物，以及1 pg–10 ng携带插入区域的DNA样本。加入dH₂O至终体积为50 µl。
   3. 设定热循环程序如下：98 °C预变性10秒；进行30个循环，每个循环包括98 °C变性10秒，退火温度为两个引物中较低熔解温度加3 °C，退火时间20秒；最后在72 °C延伸10分钟。PCR产物保存于4 °C。
   4. 取上一步所得PCR产物5 µl进行琼脂糖凝胶电泳。
      1. 使用0.7%琼脂糖凝胶，1× TAE缓冲液（40 mM Tris-乙酸盐，1 mM EDTA），终浓度为0.5 μg/ml的溴化乙锭（EtBr）作为染色剂，并以1 kb DNA ladder作为分子量标准。电源电压设定为每厘米电极间距5 V。当上样染料迁移至凝胶长度约2/3处时停止电泳。使用凝胶成像系统观察结果。
         注意：EtBr为疑似致癌物，必须按照机构规定妥善处理。操作含EtBr的凝胶时应始终佩戴手套。为防止交叉污染，在处理完含EtBr材料后、接触其他材料或设备前，需更换新手套。
   5. 若仅检测到一条大小与预期PCR产物相符的DNA条带，则使用商业纯化试剂盒（如QIAquick PCR纯化试剂盒）按照制造商说明书纯化剩余PCR产物。
      1. 若存在其他非特异性条带，则使用剩余PCR产物进行制备型凝胶电泳。参数和条件同步骤1.1.4。确保凝胶孔足够大，可加载约45 µl PCR产物。切下目标条带，使用QIAquick凝胶回收试剂盒按照制造商说明书从凝胶中提取DNA。
2. 将插入片段导入全长感染性HIV-1 B亚型载体（pNL4-3）
   1. 使用步骤1.1.5中纯化的PCR产物作为引物。在一个PCR反应中以pNL4-3VifA为模板DNA，在另一反应中以pNL4-3VifB为模板（图1）。每个PCR反应体系包含：1×高保真缓冲液、0.2 mM dNTPs、2 U高保真DNA聚合酶、500 ng引物DNA、50 ng模板DNA，终体积为50 µl。热循环参数设置为：98 °C 30秒；35个循环（98 °C 10秒，48 °C 1分钟，72 °C 10分钟）；最后72 °C延伸10分钟。
   2. 向50 µl PCR反应体系中加入10 U DpnI，在37 °C孵育1小时以消化模板DNA。确保质粒DNA来源于具有甲基化能力的细菌菌株，例如TOP10化学感受态Escherichia coli。
   3. 使用经DpnI消化的产物转化感受态细菌细胞。采用热激法转化TOP10化学感受态E. coli，具体操作按照制造商说明书进行。为筛选含有重组质粒的细菌细胞，使用含100 mg/L羧苄青霉素的Luria Broth（LB）培养基平板。
      1. 挑选约10个分离良好的单菌落，分别接种于3 ml含100 mg/L羧苄青霉素的LB液体培养基中，30 °C摇床过夜（O/N）培养。
      2. 使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒按照制造商说明书从细菌液体培养物中提取质粒DNA。
   4. 采用双酶切鉴定质粒DNA是否正确插入片段。确保其中一个限制性酶切位点仅存在于插入区域内，另一个限制性酶切位点在HIV-1载体中仅出现一次，且位于插入区域之外。
      1. 在终体积10 µl的反应体系中消化至少300 ng质粒DNA。根据所选限制性内切酶的制造商说明书选择合适的酶切缓冲液、孵育温度和时间。取9 µl酶切后的DNA，按步骤1.1.4所述进行凝胶电泳。选择产生预期大小DNA条带的重组质粒。
   5. 通过Sanger测序确认重组质粒的序列完整性。尽管罕见，但在PCR过程中可能引入非预期突变。
      1. 对质粒DNA的两条链均进行测序。参照步骤1.1.1.i设计测序引物。此外，确保正向和反向测序引物分别在重组质粒中插入区域上游和下游至少退火50 bp。
      2. 将质粒DNA和测序引物送至商业DNA测序服务公司。按照服务商要求准备DNA样本和引物。
   6. 使用无内毒素质粒DNA提取试剂盒，按照制造商说明书制备突变体质粒DNA的无内毒素储备液。为后续转染步骤准备至少1 µg无内毒素质粒DNA。
3. 通过定点突变引入小规模突变
   1. 设计包含目标突变的重叠正向和反向诱变引物。将需要替换、插入或删除的碱基置于引物中间，两侧各保留10–15个同源碱基。参照步骤1.1.1.i中的说明进行设计。
   2. 使用PCR合成突变体质粒。每个PCR反应体系包含：1×高保真缓冲液、10 mM dNTPs、2 U高保真DNA聚合酶、0.5 µM正向诱变引物、0.5 µM反向诱变引物，以及50 ng来自步骤1.2.6的嵌合pNL4-3VifB，终体积为50 µl。热循环参数设置为：98 °C 30秒；25个循环（98 °C 10秒，48 °C 1分钟，72 °C 10分钟）；最后72 °C延伸10分钟。
   3. 重复步骤1.2.2至1.2.6。

2. 通过转染生成病毒毒种

1. 计算所需的病毒储存液量和质粒DNA用量。当病毒滴度为每毫升10⁴感染单位（IU）或更高时，1.8 ml病毒储存液足以用于两组生长竞争实验，包括单独感染实验，每组均设三个重复。在6孔板中进行转染时，每孔可收获约1.8 mL上清液。每个在6孔板中进行的转染需要1 µg质粒DNA。
2. 对于6孔板中的每一孔，准备100 µl转染混合物，例如包含1 µl X-tremeGENE 9转染试剂（或类似产品）、1 µg质粒DNA以及无血清的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）。
   1. 根据每孔1 µg质粒DNA确定所需质粒DNA体积。确保质粒DNA的最终浓度至少为50 ng/µl。
   2. 使用以下公式计算每孔所需无血清培养基（DMEM）的体积：DMEM总体积（µl）= 100 µl - DNA体积（µl）。
3. 在6孔板中每孔加入10⁶个人类胚胎肾细胞或HEK 293T-17（ATCC）细胞，加入2 ml增殖培养基（DMEM + 10%胎牛血清（FBS））。在37 °C、5% CO₂条件下孵育1小时。根据步骤2.1确定所需孔数并接种相应数量的孔。
4. 准备转染混合物时，将上述计算所得适量的无血清DMEM移入1.8 ml聚丙烯微量离心管中，然后加入转染试剂。
   1. 将试剂直接吹打加入培养基溶液中，不要将其加到微量离心管的塑料管壁上。最后加入质粒DNA。轻轻吹打数次以混匀溶液。室温（RT，15 °C至25 °C）孵育15分钟，以形成转染复合物。
   2. 将混合物逐滴加入已接种于6孔板中的细胞中。轻轻摇动或旋转孔板，确保转染复合物均匀分布。
   3. 用塑料封口膜密封孔板。
5. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育细胞48小时。
6. 使用移液器小心收集上清液，并通过0.22 µm滤器顶部转移至15 ml离心管中。
7. 使用移液器将250 µl或更多的过滤后上清液转移至带有橡胶垫圈盖子的1.8 ml微量离心管中。
8. 将过滤后的上清液储存于-80 °C，直至使用。

3. 建立病毒生长动力学

1. 单一感染
   1. 在48孔板中，每孔接种3 × 10⁵个经PHA刺激的外周血单个核细胞（PBMC），总体积为500 µl/孔。将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中，直至接种病毒。
   2. 针对每种病毒，用2 ml完全Iscove改良Dulbecco培养基（cIMDM）配制含6,000 IU的接种液。
   3. 取500 µl接种液（含1,500 IU）加入已接种细胞的孔中，每组设三个复孔。感染后细胞培养终体积为1 ml/孔，感染复数（MOI）为0.005。
   4. 将剩余接种液分装200 µl至两个96孔板中用于RNA提取，其中一个作为备份保存。
   5. 将培养物置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育16–24小时。
   6. 接种后16–24小时洗涤培养物。
      1. 吸除并弃去750 µl培养上清液。
      2. 加入750 µl新鲜cIMDM，用封口膜封板后在300 × g下离心10分钟，随后吸除并弃去750 µl上清液。
      3. 再加入750 µl新鲜cIMDM，于37 °C、5% CO₂条件下孵育（第1天）。
   7. 从第2天至第7天每天取样。
      1. 将500 µl培养上清液转移至1.8 ml离心管中，在3,000 × g下离心1分钟。
      2. 取200 µl无细胞上清液分装至两个96孔样品板中用于RNA提取，其中一个作为备份保存。将上清液储存于-80 °C，直至进行RNA提取。
      3. 向每孔培养物中加入500 µl新鲜cIMDM，置于37 °C、5% CO₂条件下继续孵育。
      4. 实验结束后，将培养物弃入Wescodyne溶液中处理。
      5. 使用200 µl上清液提取RNA（可采用商业试剂盒，如QIAamp Viral RNA Mini Kit），按照制造商的标准操作流程进行。若样本量较大，可使用Qiagen QIAxtractor系统。
      6. 将提取的RNA样本储存于-80 °C，直至进行cDNA合成。
2. cDNA合成（逆转录）
   1. 对于每个RNA样本，在10 µl病毒RNA中加入1.2 nmol dNTP和1.2 pmol cDNA合成引物（5’-GTTGATCCTTTAGGTATCTTTCCACAGC-3’，对应HXB2核苷酸7968至7995），加水至终体积14 µl。轻弹管壁混匀，短暂离心使液体沉至管底。
   2. 于65 °C孵育5分钟，然后置于4 °C保存，直至配制完成主混合液。
   3. 配制主混合液：使用5×第一链缓冲液（250 mM Tris-HCl，pH 8.3，375 mM KCl，15 mM MgCl₂）、5 mM二硫苏糖醇（DTT）、120 U SuperScriptIII和240 U RNase抑制剂，加水至终体积10 µl。
   4. 向RNA混合物中加入10 µl主混合液，轻弹混匀后短暂离心收集液体。
   5. 于50 °C孵育90分钟，以完成cDNA合成；再于70 °C孵育15分钟以灭活逆转录酶。根据需要可暂存于4 °C。
   6. 加入2 U RNase H，轻弹混匀后短暂离心收集。
   7. 于37 °C孵育20分钟。将合成的cDNA储存于-20 °C。

4. 生长竞争实验

1. 在48孔平底培养板中，每孔以500 µl总体积接种3 × 10⁵个PHA刺激的外周血单个核细胞（PBMCs）或1 × 10⁵个CEM×174细胞。
2. 将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中，直至接种病毒。
3. 针对每种病毒，制备含有6,000 IU的接种液3 ml。
4. 将每种病毒接种液各1.5 ml转移至无菌离心管中，制备双病毒感染接种液。取500 µl双病毒感染接种液（含1,500 IU）加入含3 × 10⁵个细胞的48孔板中，最终培养体积为1 ml/孔。另取200 µl接种液分装至两块96孔板中用于RNA提取；其中一块作为备份保存。
5. 将接种后的细胞在37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育16–24小时。
6. 接种后16–24小时对培养物进行洗涤。
   1. 吸除并弃去750 µl培养上清液。
   2. 加入750 µl新鲜完全IMDM培养基（cIMDM），用封口膜包裹培养板，在300 × g条件下离心10分钟，随后吸除并弃去750 µl上清液。
   3. 再次加入750 µl新鲜cIMDM，置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育（第1天）。
7. 选择采样时间点，至少包含在步骤3.4.1中观察到的指数生长期内的3个时间点。
   1. 每次采样均按照步骤3.1.7进行。
8. 按照第3.2节所述方法进行cDNA合成。

结果

图1：利用重叠延伸PCR构建HIV-1 NL4-3 COTB Gag-p24重组分子克隆。（A）设计嵌合引物。引物的5’端包含NL4-3载体序列，3’端包含插入片段序列的末端。（B）使用嵌合引物扩增插入片段COTB Gag-p24。（C）将插入片段用作引物进行第二轮PCR，以生成新的重组质粒。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
重组克隆的构建
嵌合引物/突变引物/测序引物	IDT		定制DNA寡核苷酸
pNL4-3VifA 和 pNL4-3VifB 质粒
高保真DNA聚合酶	赛默飞世尔科技	F-549S
高保真缓冲液	赛默飞世尔科技	F-549S
脱氧核苷三磷酸（dNTP）	Bioline	Bio-39026
热循环仪	Life Technologies		Applied Biosystems® GeneAmp® PCR System 9700
DNA上样染料	赛默飞世尔科技	R0631
1 kb Plus DNA 标准品	Invitrogen	10787-018
QIAquick PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28104
QIAquick 凝胶回收试剂盒	Qiagen	28704
DpnI 酶	New England Biolabs	R0176S
TOP10 化学感受态细胞 大肠杆菌	Invitrogen	C4040-10
Luria肉汤基础粉末	Invitrogen	12795-084
羧苄青霉素	研究产品国际公司	C46000-25.0
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒	Qiagen	27104
内毒素清除型质粒大提试剂盒	Qiagen	12362
转染
X-tremeGENE 9 DNA 转染试剂	罗氏	6365787001
HEK 293T-17	ATCC	CRL-11268	http://www.atcc.org/
0.22 μm 滤器上端管	VWR International	89220-716
细胞培养
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Life Technologies	10566016
Iscove′s 改良 Dulbecco′s 培养基 (IMDM)	Life Technologies	31980-030
RPMI-1640 培养基	Life Technologies	61870-036
植物血凝素（PHA）	赛默飞世尔科技	R30852801
人白细胞介素-2	罗氏	11147528001
胎牛血清	JR Scientific	43640
青霉素和链霉素	Corning Cellgro	30-001-CI
6 孔板	VWR Scientific	73520-906
48孔板	VWR Scientific	62407-338
96孔平底板	ISC Bioexpress	T-3015-4
96孔圆底板	BD Falcon	353077
1.5 ml 微型离心管	贝克山生物	MBD-1500
带O形圈的1.5 ml离心管	VWR Scientific	89004-290
50 ml 一次性塑料离心管	ISC Bioexpress	C-3317-6