利用质粒转染在人源细胞中生产假病毒

摘要

来源：Chang, X., et al. 利用磷酸钙转染法构建假型H5亚型禽流感病毒及抗体中和活性检测. J. Vis. Exp. (2021)

本视频展示了利用磷酸钙介导的质粒转染法在人源细胞中生产流感假病毒，可在生物安全二级条件下安全地生成单周期病毒颗粒，用于后续应用，例如抗体中和实验。

方案

1. 采用磷酸钙转染法进行假病毒包装

1. 在完全 DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）培养基中制备 HEK293FT 细胞的单细胞悬液（9 × 10⁵ 个/mL）（表 1）。取 10 mL 单细胞悬液加入 T75 培养瓶中，在转染前于 37 °C、5% 二氧化碳（CO₂）培养箱中孵育 20 小时。
   注意：建议使用低代次 HEK293FT 细胞（<20 代）。确保细胞单层融合度达到 80–90%。
2. 转染前 2 小时，将培养基更换为含氯喹（100 µM）的新鲜完全培养基 10 mL。
3. 按照表 2和图 1所示混合试剂与质粒 DNA：ddH₂O（双蒸水）、pCMV/R-HA、pCMV/R-NA、pHR-Luc、pCMV Δ8.9、2.5 M CaCl₂（氯化钙）以及 2× 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲液。轻轻吹打混匀 5 次，在室温（RT）下孵育 20 分钟。
4. 将混合物转移至细胞上方的培养基中，轻轻摇动培养瓶。在细胞培养箱中继续孵育 15 小时。
5. 更换为 15 mL 新鲜完全 DMEM 培养基。在 37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育 65 小时。
   注意：培养基颜色应呈浅橙色或微黄色，在倒置显微镜下至少 80% 的细胞应显示细胞病变效应（CPE）。
6. 收集上清液，在 4 °C 下以 2095 × g 离心 20 分钟。收集上清液，分装后于 -80 °C 保存。

表1：完全DMEM培养基成分。

完全DMEM培养基成分	浓度
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	1x
胎牛血清	10%
青霉素(1 U/mL)/链霉素	1 μg/ mL

表2：假病毒包装系统。

材料	浓度	体积
2x HEPES (pH 7.1)	--	675.0 μL
CaCl2 (2.5 M)	--	67.5 μL
ddH2O	--	529.2 μL
pCMV Δ 8.9	1000 ng/μL	18.9 μL
pCMV/R-HA	100 ng/μL	27.0 μL
pCMV/R-NA	50 ng/μL	13.5 μL
pHR-Luc	1000 ng/μL	18.9 μL

结果

图1：钙介导转染流程图。该流程图用于描述钙介导转染的主要操作步骤。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无水氯化钙	AMRESCO	1B1110-500G	试剂
磷酸氯喹	Selleck	S4157	试剂
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco	12100-046	试剂
胎牛血清	Gibco	16000-044	试剂
HEK293FT	Gibco	R700-07	细胞系
HEPES 游离酸	AMRESCO	0511-250G	试剂
HIV-1 p24 抗原 ELISA	ZeptoMetrix	801111	试剂盒
荧光素酶检测试剂盒冷冻包	Promega	E4530	试剂盒
微量离心管 1.5 mL	Thermo fisher scientific	509-GRD-Q	耗材
Nunc 圆锥形离心管 15 mL	Thermo fisher scientific	339650	耗材
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122	试剂
移液器吸头（10 μL）	Thermo fisher scientific	TF102-10-Q	耗材
移液器吸头（100 μL）	Thermo fisher scientific	TF113-100-Q	耗材
移液器吸头（1000 μL）	Thermo fisher scientific	TF112-1000-Q	耗材
血清移液管（5 mL）	Thermo fisher scientific	170355N	耗材
血清移液管（10 mL）	Thermo fisher scientific	170356N	耗材