利用基于荧光素酶的假病毒感染实验确定最佳靶细胞密度

摘要

来源： Chang, X., 等 利用磷酸钙转染法制备假型H5亚型禽流感病毒及抗体中和活性检测 视频实验杂志 (2021)

本视频展示了一种基于荧光素酶的假病毒滴定检测方法，用于确定实现最大感染效率的最佳靶细胞密度。通过比较不同细胞密度下的发光信号，该方法可确保后续应用中检测的高灵敏度和可重复性。

方案

1. 假病毒滴定

1. 将Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞用完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM培养基）制成单细胞悬液（5 × 10⁴ 个/mL），并将1250、2500、5000、10000、20000和40000个细胞分别加入96孔平底板的不同孔中。将细胞置于37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育20小时。
2. 从-80 °C冰箱中取出假病毒，在冰上解冻，并对假病毒进行涡旋振荡。
3. 向96孔圆底板的每孔中加入6 HAU（6倍血凝单位）假病毒，并用完全DMEM补足每孔体积至120 µL。
4. 用移液器将混合液上下吹打5次以充分混匀。将混合液板置于37 °C、5% CO₂ 培养箱中孵育1小时。
5. 将100 µL混合液转移至96孔板中的细胞中。病毒感染后，将细胞培养板重新放回培养箱中继续培养48小时、60小时和72小时。
6. 将培养板从培养箱中取出，进行荧光素酶检测。
7. 小心移除孔中的培养基，用200 µL磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞，并尽可能去除PBS。
   注意：将板倒置，轻拍于吸水纸上以去除上清液。若待测细胞系不能牢固贴壁，应小心用抽吸法去除培养基。
8. 每孔加入50 µL裂解缓冲液，轻轻摇动培养板数次。将板置于-80 °C过夜保存。
   注意：将1体积的5×裂解缓冲液与4体积的水混合，配制成1×裂解缓冲液。使用前将1×裂解缓冲液平衡至室温（RT）。轻轻摇动培养板，确保细胞完全被裂解缓冲液覆盖。一次冻融循环有助于细胞完全裂解。
9. 将板取出，在室温下平衡2小时。
   注意：细胞应已完全裂解。
10. 轻轻摇动培养板数次，将所有细胞裂解物转移至不透光的96孔板中。
11. 每孔加入50 µL底物，轻轻摇动培养板数次，使底物与裂解缓冲液充分混匀。
12. 在5分钟内使用发光仪测量产生的光信号。记录假病毒的荧光素酶滴度。
    注意：当加入适当的底物后，荧光素酶催化荧光素转化为氧荧光素，产生光作为化学反应的副产物。所产生的光量与荧光素酶的量成正比。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔细胞培养板（平底）	Thermo Fisher Scientific	167008	耗材
96孔细胞培养板（圆底）	Thermo Fisher Scientific	163320	耗材
Allegra X-15R	Beckman Coulter	--	设备/离心机
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco	12100-046	试剂
荧光素酶检测试剂盒冷冻包装	Promega	E4530	试剂盒
MDCK.1	ATCC	CRL-2935	细胞系
微量离心管 1.5 mL	Thermo Fisher Scientific	509-GRD-Q	耗材
移液器吸头（10 μL）	Thermo Fisher Scientific	TF102-10-Q	耗材
移液器吸头（100 μL）	Thermo Fisher Scientific	TF113-100-Q	耗材
移液器吸头（1000 μL）	Thermo Fisher Scientific	TF112-1000-Q	耗材