利用荧光素酶报告基因检测评估假病毒感染

摘要

来源：Chang, X., 等. 利用磷酸钙转染法构建假型H5禽流感病毒及抗体中和活性检测. J. Vis. Exp. (2021).

本视频展示了一种基于荧光素酶的检测方法，用于定量上皮细胞中的假病毒侵染。该假病毒编码荧光素酶基因，并在被感染细胞中表达。洗涤后，细胞在超低温条件下与裂解缓冲液孵育，随后解冻以诱导细胞裂解。将裂解液转移至不透光的检测板中，加入底物后，通过测量发光信号来评估侵染水平。

方案

1. 假病毒滴定

1. 将Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞用完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）制成单细胞悬液（5 × 10⁴ 个/mL），并将1250、2500、5000、10000、20000和40000个细胞分别加入96孔平底板的不同孔中。将细胞置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育20小时。
2. 从-80 °C冰箱中取出假病毒，在冰上融化，并对假病毒进行涡旋振荡。
3. 向96孔圆底板的每孔中加入6 HAU（6×血凝单位）假病毒，并用完全DMEM补足每孔体积至120 µL。
4. 用移液器将混合液上下吹打5次以充分混匀。将混合液板置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育1小时。
5. 将100 µL混合液转移至96孔板中的细胞中。在病毒感染后，将细胞培养板放回培养箱中继续培养48小时、60小时和72小时。
6. 将培养板从培养箱中取出，进行荧光素酶检测（材料表）。
7. 小心吸除板孔中的培养基。用200 µL磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞，并尽可能去除PBS。
   注意：将板倒置，在吸水纸上反向轻拍以弃去上清液。若待测细胞系不能牢固贴壁，应小心用抽吸法去除培养基。
8. 向每孔中加入50 µL裂解缓冲液，并轻轻摇动培养板数次。将板置于-80 °C过夜保存。
   注意：将1体积的5×裂解缓冲液与4体积的水混合，配制成1×裂解缓冲液。使用前将1×裂解缓冲液平衡至室温（RT）。轻轻摇动板以确保细胞完全被裂解缓冲液覆盖。一次冻融循环有助于细胞完全裂解。
9. 将板从-80 °C取出，在室温下平衡2小时。
   注意：细胞应已完全裂解。
10. 轻轻摇动板数次，将所有细胞裂解物转移至不透光的96孔板中。
11. 向每孔中加入50 µL底物，轻轻摇动板数次，使底物与裂解缓冲液充分混匀。
12. 在5分钟内使用发光仪测定产生的光信号。记录假病毒的荧光素酶滴度。
    注意：当加入合适的底物后，荧光素酶催化荧光素转化为氧荧光素，此化学反应副产物为光。所产生的光量与荧光素酶的量成正比。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔细胞培养板（平底）	Thermo Fisher Scientific	167008	耗材
96孔细胞培养板（圆底）	Thermo Fisher Scientific	163320	耗材
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco	12100-046	试剂
胎牛血清	Gibco	16000-044	试剂
荧光素酶检测试剂盒冷冻包装	Promega	E4530	试剂盒
MDCK.1	ATCC	CRL-2935	细胞系
1.5 mL 微量离心管	Thermo Fisher Scientific	509-GRD-Q	耗材
Nunc 圆锥形离心管 15 mL	Thermo Fisher Scientific	339650	耗材
Nunc 圆锥形离心管 50 mL	Thermo Fisher Scientific	339652	耗材
Nunc EasYFlask 75 cm²	Thermo Fisher Scientific	156499	耗材
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122	试剂
移液器吸头（10 μL）	Thermo Fisher Scientific	TF102-10-Q	耗材
移液器吸头（100 μL）	Thermo Fisher Scientific	TF113-100-Q	耗材
移液器吸头（1000 μL）	Thermo Fisher Scientific	TF112-1000-Q	耗材
血清移液管（5 mL）	Thermo Fisher Scientific	170355N	耗材
血清移液管（10 mL）	Thermo Fisher Scientific	170356N	耗材