基于马铃薯病毒X的马铃薯植株microRNA沉默

摘要

来源：Zhao, J., 等．马铃薯X病毒介导的microRNA沉默（VbMS）在马铃薯中的应用．J. Vis. Exp. （2020）

本视频演示了利用 Agrobacterium tumefaciens 将基于马铃薯X病毒（PVX）的载体导入体外培养的马铃薯植株，以实现病毒介导的microRNA沉默（VbMS）。该方法可实现对目标microRNA的系统性抑制，使研究人员能够通过可观察的表型变化来研究其在植物发育中的作用。

方案

1. 在马铃薯植株中进行基于PVX的VbMS检测。

1. 将4周大的离体马铃薯植株移栽至土壤中。移栽后的植株在3–4天后进行VbMS检测。
2. 用农杆菌接种马铃薯植株 农杆菌 含有PVX-STTM（短串联靶标模拟物）质粒。
   注意： 对于马铃薯中的VbMS检测， 农杆菌介导的侵染与牙签划伤接种同时进行。
   1. 挑取含有PVX-STTM载体的阳性转化子，接种于50 mL含有50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL利福平的液体LB培养基中 50 μg/mL 卡那霉素和 50 μg/mL 利福平。在28 °C、220 rpm条件下培养16小时，直至OD600达到1.0。 28 °C 220 rpm 条件下培养 16 小时，直至 OD₆₀₀ = 1.0.
   2. 同时，将阳性 农杆菌 菌落划线接种至至少两个新的含LB培养基平板，其中添加 50 μg/mL 卡那霉素和 50 μg/mL 利福平，并在28 °C下培养1天。 28 °C 培养1天。以PVX-LIC载体作为对照，并使用PVX-GFP监测病毒扩散。
   3. 收集 农杆菌 3,400 × g 离心液体培养物 g 在室温下静置10分钟。重悬 农杆菌 用等体积的浸润缓冲液（10 mM MgCl₂, 10 mM MES, 和 200 µM 乙酰丁香酮，pH = 5.6）重悬农杆菌细胞，并调整至 OD₆₀₀ = 1.0。室温孵育 6 小时。₂10 mM MES 和 200 µM 乙酰丁香酮，pH = 5.6）并调节至OD₆₀₀ = 1.0。室温孵育6小时。
   4. 浸润 农杆菌 用1 mL无针注射器将菌液注入完全展开叶片的远轴面。
      1. 用一只手翻转并固定叶片，然后用另一只手的一根手指从近轴面支撑叶肉的注射位点。另一只手保持注射器垂直于叶表面，将农杆菌菌液注入叶肉的远轴面。 农杆菌 将菌液注入叶片下表面的叶肉部分。
   5. 刮取 农杆菌 从LB平板上刮取菌液，用牙签轻轻刮擦已接种的马铃薯植株第一个或第二个节间的茎表面。轻轻刮破茎的表皮，避免刺穿茎部，以免对植株造成严重损伤。
3. 将侵染后的植株置于温室中培养，培养条件为22 °C，光周期16小时光照/8小时黑暗，光照强度120 μmol/m2∙s1。 22 °C 16小时光照/8小时黑暗的光周期，光照强度为 120 μmol/m²∙ s¹ 在温室中
   注意： 由miRNA沉默引起的表型通常在接种后2–4周出现（图1, 图2VbMS表型通常在侵染后10–20天出现。VbMS表型的呈现取决于特定miRNA及其靶基因的特性、生长条件和马铃薯品种。

结果

图1：四倍体马铃薯品种Katahdin中miR165/166的病毒诱导的miRNA沉默（VbMS）。 表达PVX载体对照或PVX-STTM165/166的马铃薯植株（Katahdin）表型。品红色箭头指示叶片脉络中异位产生的叶结构。橙色箭头指示喇叭状叶结构。标尺 = 1 cm。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
农杆菌菌株：GV3101、GV2260 或 EHA105。
肥料：Peters Peat Lite Special 15-0-15 Dark Weather Feed	ICL Specialty Fertilizers, Summerville, SC 29483, USA	G99260
MgCl₂	ThermoFisher, Waltham, MA 02451, USA	MFCD00149781
PVX VIGS 载体：PVX-LIC
土壤：Metro-Mix 360	Sun Gro Horticulture, Agawam, MA 01001-2907, USA	Metro-Mix 360
			Zhao 等，2016