利用pH控制梯度离心法在体外拆解甲型流感病毒核心

摘要

本视频展示了利用梯度超速离心法研究pH依赖性的甲型流感病毒（IAV）核心颗粒解离过程。内容包括甘油梯度的制备、超速离心操作，以及不同pH条件对IAV核心颗粒解离的影响。

1. 缓冲液和储备溶液的配制

通过将470 mg Tris盐酸盐、390 mg MES水合物和580 mg NaCl溶解于80 ml ddH₂O中，配制MNT缓冲液（20 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）、30 mM Tris和100 mM NaCl）。用ddH₂O将缓冲液调至pH 7.4，并定容至100 ml。
分别称取9.76 g MES水合物，各溶于80 ml dH₂O中，配制三份相同的500 mM MES缓冲液。分别用浓NaOH滴定，将缓冲液pH调节至5.8、5.4和5.0，再用dH₂O定容至100 ml。
分别称取7.88 g Tris盐酸盐，各溶于80 ml dH₂O中，配制两份相同的500 mM Tris缓冲液，并分别用浓HCl滴定调节pH至7.4和6.4，再用dH₂O定容至100 ml。
在dH₂O中配制50%甘油溶液，充分搅拌至甘油均匀混合。使用Steritop滤器（孔径0.22 µm）将溶液过滤至玻璃瓶中。
在dH₂O中配制10% NP-40溶液和1 M NaCl溶液。
将两片蛋白酶抑制剂片剂溶于4 ml ddH₂O中，配制成25倍浓缩的蛋白酶抑制剂溶液。

2. 甘油梯度的制备

为每个待测试的 pH 条件（pH 7.4、6.4、5.8、5.4 和 5.0）配制 5 ml 去垢剂缓冲液主混合液（含 300 mM NaCl、2% NP-40 和 2 倍浓度的蛋白酶抑制剂）。为此，将 9 ml 的 1 M NaCl、6 ml 的 10% NP-40、2.4 ml 的 25 倍浓度蛋白酶抑制剂储备液以及 9 ml 的 ddH₂O 混合。
对每个 pH 条件，将 4.4 ml 主混合液用移液器转移至 50 ml 锥形管中。
对于 pH 高于 5.8 的条件，向管中加入 0.6 ml 相应 pH 调节的 500 mM Tris 储备液；对于 pH 5.8 及更低的条件，加入 0.6 ml 相应 pH 调节的 500 mM MES 储备液。
配制 5 ml 缓冲液，其中含 300 mM NaCl、2 倍蛋白酶抑制剂、60 mM Tris（调节至 pH 7.4）以及 ddH₂O。该缓冲液将作为无去垢剂对照梯度缓冲液。
如有必要，分别加入浓盐酸（HCl）或氢氧化钠（NaOH）溶液，将各溶液的 pH 精细调节至 pH 7.4、6.4、5.8、5.4 和 5.0。
将 5 ml 的 50% 甘油储备液加入 5 ml 含去垢剂及无去垢剂的缓冲液混合物中，得到六种不同的 25% 甘油溶液。使用 pH 指示试纸验证各溶液的 pH 值。
注意： 若测得的 pH 值与目标值差异显著，则应重新配制相应溶液。
通过将 50% 甘油储备液与 dH₂O 按 3:7 的比例混合，配制 15% 甘油溶液。

3. 甲型流感病毒（IAV）的超速离心

使用5 ml注射器和针头（21 G，9 cm长）将3 ml 15%甘油溶液加入超清晰离心管（13.2 ml，14 mm × 89 mm）中。避免在管内壁残留液滴，以免影响梯度的完整性。重复此操作，共准备六根离心管，分别用于五个待测pH条件及一个对照样品。
使用5 ml注射器和长针头，将3.4 ml 25%甘油溶液小心地注入15%甘油层下方，注意避免混合两层液体。针对所有六种测试条件，分别使用pH值已调节的甘油溶液重复此操作。
注意： 在以下步骤中，于II级生物安全柜中操作。
用含有IAV（X31，H3N2）的30 µl澄清尿囊液，以1 ml MNT缓冲液稀释至总病毒蛋白约20–30 µg，轻柔地覆盖在每条蔗糖甘油梯度上。
将相对的离心管平衡后放入SW41超速离心转子中。在55,000 × g、12 °C条件下离心150分钟。
离心后，小心移除上清液，即使用干净的巴氏吸管和抽吸装置，分别收集两层甘油溶液。将沉淀重悬于40 µl（1倍体积）非还原型十二烷基硫酸锂（LDS）上样缓冲液中。需反复吹打数次，以确保沉淀完全溶解。将样品转移至1.5 ml微量离心管中。

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