利用pH控制梯度离心法在体外拆解甲型流感病毒核心

摘要

来源：Stauffer, S. et al. 通过梯度离心法在体外拆解甲型流感病毒衣壳。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了利用梯度超速离心法研究pH依赖性的甲型流感病毒（IAV）核心颗粒解离过程。内容包括甘油梯度的制备、超速离心操作，以及不同pH条件对IAV核心颗粒解离的影响。

方案

1. 缓冲液和储备溶液的配制

1. 通过将470 mg Tris盐酸盐、390 mg MES水合物和580 mg NaCl溶解于80 ml ddH₂O中，配制MNT缓冲液（20 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）、30 mM Tris和100 mM NaCl）。用ddH₂O将缓冲液调至pH 7.4，并定容至100 ml。
2. 分别称取9.76 g MES水合物，各溶于80 ml dH₂O中，配制三份相同的500 mM MES缓冲液。分别用浓NaOH滴定，将缓冲液pH调节至5.8、5.4和5.0，再用dH₂O定容至100 ml。
3. 分别称取7.88 g Tris盐酸盐，各溶于80 ml dH₂O中，配制两份相同的500 mM Tris缓冲液，并分别用浓HCl滴定调节pH至7.4和6.4，再用dH₂O定容至100 ml。
4. 在dH₂O中配制50%甘油溶液，充分搅拌至甘油均匀混合。使用Steritop滤器（孔径0.22 µm）将溶液过滤至玻璃瓶中。
5. 在dH₂O中配制10% NP-40溶液和1 M NaCl溶液。
6. 将两片蛋白酶抑制剂片剂溶于4 ml ddH₂O中，配制成25倍浓缩的蛋白酶抑制剂溶液。

2. 甘油梯度的制备....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
cOmplete™，无EDTA蛋白酶抑制剂片剂	Sigma-Aldrich	11873580001	储存液可在2至8 °C下保存1至2周
无水甘油 BioChemica	AppliChem	A1123
盐酸	Merck Millipore	100317
长注射针头（21 G，9 cm，斜面或钝端）
MES 一水合物	Sigma-Aldrich	M8250
NP-40	Sigma-Aldrich	I8896	现可商业购得为 IGEPAL® CA-630
pH 指示试纸，pH 4.0–7.0	Merck Millipore	109542
氯化钠	Merck Millipore	106406
氢氧化钠	Merck Millipore	106498
Steritop 滤器单元	Merck Millipore	SCGPT05RE
SW41 Ti 超速离心转子组件	Beckman Coulter	331336
薄壁超透明离心管，13.2 ml，14 mm × 89 mm	Beckman Coulter	344059
Tris 盐酸盐	AppliChem	A1087
X31 流感病毒 A 型（H3N2），鸡蛋培养，澄清的尿囊液	Virapur		在4 °C下新鲜解冻