可视化pH对甲型流感病毒核心溶解作用的影响

摘要

本视频展示了 pH 值对甲型流感病毒核心溶解作用的影响。通过凝胶电泳和蛋白质染色，揭示了在酸性条件下病毒核心结构的逐步解离过程。

1. 甘油梯度的制备

为每个待测试的 pH 条件（pH 7.4、6.4、5.8、5.4 和 5.0）配制 5 ml 去垢剂缓冲液主混合液（含 300 mM 氯化钠或 NaCl、2% 非离子型去垢剂（NP-40）、2 倍浓度的蛋白酶抑制剂）。为此，将 9 ml 的 1 M NaCl、6 ml 的 10% NP-40、2.4 ml 的 25 倍浓度蛋白酶抑制剂储备液以及 9 ml 的 ddH₂O 混合。
对每个 pH 条件，将 4.4 ml 主混合液用移液器转移至 50 ml 锥形管中。
对于 pH 值高于 5.8 的条件，向管中加入 0.6 ml 相应 pH 调节后的 500 mM Tris 储备液；对于 pH 5.8 及更低的条件，加入 0.6 ml 相应 pH 调节后的 500 mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）储备液。
配制 5 ml 缓冲液，其中含 300 mM NaCl、2 倍浓度蛋白酶抑制剂、60 mM Tris（调节至 pH 7.4）以及 ddH₂O。该缓冲液将作为无去垢剂的对照梯度缓冲液。
如有必要，分别通过加入浓盐酸（HCl）或氢氧化钠（NaOH）溶液，将各溶液的 pH 精细调节至 pH 7.4、6.4、5.8、5.4 和 5.0。
将 5 ml 的 50% 甘油储备液加入 5 ml 含去垢剂及无去垢剂的缓冲液混合物中，得到六种不同的 25% 甘油溶液。使用 pH 指示试纸验证 pH 值。
注意：若测得的 pH 值与目标值差异显著，则应重新配制相应溶液。
通过将 50% 甘油储备液与 dH₂O 按 3:7 的比例混合，配制 15% 甘油溶液。

2. 流感病毒A型（IAV）的超速离心

使用5 ml注射器和针头（21 G，9 cm长）将3 ml 15%甘油溶液加入超清离心管（13.2 ml，14 mm x 89 mm）中。避免在管内壁留下液滴，以免影响梯度的完整性。共重复此操作六次，即共准备六根离心管，分别用于五个待测pH条件和一个对照样品。
使用5 ml注射器和长针头，将3.4 ml 25%甘油溶液小心地加至15%甘油层下方。注意不要混合两层液体。对所有六种待测条件，分别使用相应pH调节的甘油溶液重复此步骤。
注意：后续步骤需在II级生物安全柜中操作。
在每根梯度管中，轻轻将含有IAV（X31，H3N2）的澄清尿囊液30 µl（用1 ml MNT缓冲液稀释，相当于约20–30 µg总病毒蛋白）覆盖于甘油梯度上方。
将相对位置的离心管配平后，放入SW41摆动转子超速离心机中。在55,000 × g、12 °C条件下离心150分钟。
离心结束后，使用洁净的巴斯德吸管和抽吸装置小心移除上清液（即两层甘油溶液）。将沉淀物重悬于40 µl（1×）非还原型十二烷基硫酸锂（LDS）样品缓冲液中。务必反复吹打数次，以确保沉淀完全溶解。将样品转移至1.5 ml微量离心管中。

3. 上清组分的SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色

将所有样品在 95 °C 下加热 10 分钟。此时，样品可保存在 -20 °C，直至通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分析。
将 20 µl 溶解后的沉淀物上样至预制的梯度（4-12%）Bis-Tris mini 胶，在 1x MOPS SDS 电泳缓冲液中以 200 V 电压运行 1 小时。
用 40% 甲醇和 10% 冰醋酸溶于 ddH₂O 中配制固定液。
将凝胶在固定液中孵育 1 小时，然后在 15 cm 细胞培养皿中加入足量胶体考马斯亮蓝染色液，于室温轻轻振荡过夜染色。
注意：必须将培养皿盖紧，以避免染色液蒸发。
用 ddH₂O 对凝胶进行脱色，每 15–20 分钟更换一次 ddH₂O，直至凝胶背景清晰。将凝胶保存在 4 °C 的 ddH₂O 中，直至进行条带定量扫描。
高分辨率扫描凝胶，并使用市售或自行开发的软件对蛋白质条带强度进行定量。从靠近各条带的区域扣除背景信号，并将所得数值归一化至无去垢剂的对照样品（pH 7.4）。

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