小鼠视网膜冷冻切片的制备以评估腺相关病毒对视网膜的通透性

摘要

来源：Vacca, O., et al. 利用腺相关病毒作为研究疾病中视网膜屏障的工具。J. Vis. Exp. (2015)

本视频演示了制备小鼠视网膜冷冻切片的逐步操作流程，以观察腺相关病毒在受损视网膜屏障中的通透性。

方案

所有涉及动物样本的操作均已经过适当的动物伦理审查委员会审核并批准。 

1. 对于视网膜冷冻切片（图1），解剖摘除的眼球以去除晶状体和角膜，并在4%多聚甲醛中浸没固定1小时。
   1. 将先前固定的眼球在10%蔗糖溶液中于室温下 cryoprotect 1小时，再在20%蔗糖溶液中于室温下继续处理1小时。随后在30%蔗糖溶液中于4°C过夜cryoprotect。将眼球杯冷冻并包埋于包埋介质（如Cryo-matrix）中。制备10 µm的冷冻切片，并将其贴附于专用于冷冻组织切片、可增强染色过程中组织黏附性的载玻片上。
   2. 用含0.1% Triton X-100的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）对切片进行通透处理，持续5分钟。在PBS中洗涤两次，随后在含有1%牛血清白蛋白（BSA）和0.1% Tween 20的PBS中于室温下封闭1小时。

结果

图1：通用实验流程示意图。 在完成腺相关病毒（AAV）制备后，将病毒颗粒注射至玻璃体或阴茎静脉以麻醉成年小鼠。使用Micron III相机进行眼底成像，以追踪绿色荧光蛋白（GFP）的表达。通过免疫组织化学染色和共聚焦显微镜图像，分析视网膜冷冻切片和平铺视网膜上的GFP表达模式。通过聚合酶链式反应（PCR）分析经玻璃体内或腹腔注射小鼠的血液样本，检测血液中是否存在GFP序列，从而评估AAV是否穿过血-视网膜屏障（BRB），GFP序列的存在表明AAV颗粒已进入血液循环。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Cryomatrix 包埋树脂	Thermo Scientific	6769006
Superfrost plus 黏附载玻片	Thermo Scientific	10143352
双目放大镜 SZ76	ADVILAB	ADV-76B2	变倍范围 0.66 × 5，带支架，配备 epi 和 dia 照明的 5 个 LED 灯 / 视网膜解剖
直头弹簧剪刀 - 8.5 cm	Bionic France S.a.r.l	15003-08	视网膜解剖