AAV介导的基因递送用于可视化受损的视网膜膜完整性

摘要

来源：Vacca, O., et al. 利用腺相关病毒作为研究疾病中视网膜屏障的工具。 J. Vis. Exp. (2015)。

本视频展示了在转基因小鼠视网膜中通过腺相关病毒（AAV）介导的基因递送方法，随后进行组织解剖和染色，以评估内界膜的完整性。

方案

所有涉及动物样本的实验程序均已通过相应的动物伦理审查委员会审核并批准。

1. 免疫组织化学

1. 对于视网膜平铺标本（图1），将摘除的眼球在4%多聚甲醛中固定15分钟，以利于解剖。
   1. 在15–30分钟内解剖眼球，去除角膜和晶状体。通过在锯齿缘和视神经周围剪开，将视网膜与视网膜色素上皮（RPE）和巩膜分离。再浸入4%多聚甲醛中固定30分钟，以固定视网膜及转导视网膜细胞中的荧光蛋白（固定时间不得超过24小时）。在无菌PBS（pH 7.4）中洗涤5分钟。
   2. 将磷酸盐缓冲液（PBS）更换为封闭缓冲液（含1%牛血清白蛋白（BSA）、2%正常山羊或驴血清、0.5% Triton X-100的PBS），并在封闭缓冲液中于室温孵育4小时或4 °C过夜。
2. 在封闭缓冲液中加入一抗，室温孵育4小时或4 °C过夜。用PBS洗涤3次。
   注意：所用抗体如下：抗层粘连蛋白抗体（1/1,000），标记内界膜（ILM）；抗视紫红质单克隆抗体4D2（1/500），标记视杆细胞；抗谷氨酰胺合成酶单克隆抗体GS-6（1/1,500），标记Müller细胞；花生凝集素（PNA）（1/40），标记视锥细胞。
3. 在封闭缓冲液中加入1:500稀释的Alexa Fluor标记的二抗，室温避光孵育1小时（冰冻切片）或2小时（平铺标本）。用PBS洗涤3次。
4. 在视网膜上做减张切口，并将其平铺于载玻片上，光感受器或视网膜神经节细胞（RGC）面朝上。加入水溶性封片介质，加盖盖玻片，并于4 °C保存。
5. 在激光扫描共聚焦显微镜上进行共聚焦显微成像。逐行顺序采集图像，以减少激发和发射光串扰。根据奈奎斯特–香农采样定理设定步进尺寸。采用曝光设置以最大限度减少最终图像中过饱和像素。使用FIJI软件处理12位图像，通过Z投影功能中的最大强度投影将Z轴切片投影至单一平面，最后转换为8位RGB彩色模式。

结果

图1：通用实验流程的示意图。 在腺相关病毒（AAV）制备完成后，将病毒颗粒注射至玻璃体腔或阴茎静脉以麻醉成年小鼠。使用Micron III相机进行眼底成像，以追踪绿色荧光蛋白（GFP）的表达。通过免疫组织化学染色和共聚焦显微镜成像，对视网膜冷冻切片及平铺视网膜样本中的GFP表达模式进行分析。通过PCR分析经玻璃体腔或阴茎静脉注射小鼠的血液样本，检测血液中是否存在GFP序列，从而评估AAV是否穿过血-视网膜屏障（BRB），GFP序列的存在表明AAV颗粒已进入血液循环。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Superfrost Plus 粘附载玻片	Thermo Scientific	10143352	载玻片
抗层粘连蛋白抗体	Sigma	L9393	抗体
抗视紫红质克隆 4D2	Millipore	MABN15	抗体
抗谷氨酰胺合成酶克隆 GS-6	Millipore	MAB302	抗体
抗胶质纤维酸性蛋白抗体	Dako	334	抗体
花生凝集素（PNA Lectin）	Invitrogen	L32459	探针
Alexa fluor 标记的二抗	Invitrogen		抗体
Fluorsave 封片试剂	Calbiochem	345789	封片介质
伊文思蓝染料	Sigma	E2129	染料
光谱纯甲酰胺	Sigma	295876-2L
荧光素	Sigma	F2456	染料
Micron III	Phoenix Research Labs		基于 3-CCD 彩色相机、图像采集卡和现成软件的显微成像系统，可实现小鼠视网膜成像
双目放大镜 SZ76	ADVILAB	ADV-76B2	0.66 倍至 5 倍变焦，带支架，透射与反射照明 / 用于视网膜解剖
直头弹簧剪刀 - 8.5 cm	Bionic France S.a.r.l	15003-08	视网膜解剖