重组乙型肝炎病毒颗粒的制备与纯化

摘要

来源：Nishitsuji, H., et al. 建立乙型肝炎病毒报告系统以监测复制周期的早期阶段。J. Vis. Exp. (2017)

本视频展示了重组乙型肝炎病毒颗粒的制备与纯化过程，可生成安全的、复制缺陷型病毒制剂，用于研究早期感染事件以及高通量抗病毒药物筛选应用。

方案

1. 表达报告蛋白的重组乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus, HBV）的制备

1. HepG2 细胞的制备
   1. 准备细胞培养基（添加 10% 胎牛血清 (FBS)、100 U/ml 青霉素、100 µg/ml 链霉素和 100 U/ml 非必需氨基酸的杜尔贝科改良伊格尔培养基 (DMEM)）。
   2. 在转染前一天，将 4 × 10⁶ 个 HepG2（人肝细胞癌 G2）细胞接种于含 10 ml 培养基的 10 cm 胶原包被培养皿中。将 HepG2 细胞在 37 °C、5% CO₂ 恒湿培养箱中孵育。
      注意：当约 4 × 10⁶ 个 HepG2 细胞在 10 ml 培养基的 10 cm 胶原包被培养皿中接种时，次日细胞融合度可达 70–90%。
2. 转染
   1. 使用转染试剂，按照制造商说明书，用 5 µg pUC1.2HBV delta epsilon15（一种在 epsilon 序列中存在缺失的 HBV 复制质粒）和 5 µg pUC1.2HBV/NL15 转染 HepG2 细胞。
   2. 次日，移除培养基并加入 10 ml 新鲜培养基。
   3. 转染一周后，将含有重组 HBV 的培养基转移至 50 ml 离心管中，并进行步骤 1.3.1。向含有转染细胞的培养皿中加入 10 ml 新鲜培养基。
      注意：重组 HBV 的产生可持续维持 4 周。含有重组 HBV 的培养基可在 4 °C 下保存 1 个月。
3. 重组 HBV 的纯化
   1. 通过离心（2,300 × g，4 °C，5 分钟）从含有重组 HBV 的培养基中去除细胞碎片。
   2. 将上清液通过 0.45 µm 膜滤器过滤。
   3. 向含有重组 HBV 的培养基中加入等体积的 26% PEG/1.5 M NaCl（聚乙二醇 6000：130 g，NaCl（氯化钠）：49 g，0.5 M EDTA（乙二胺四乙酸）pH 8.0：1 ml，1 M HEPES（N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸）pH 7.6：5 ml，加水至 500 ml），轻轻混匀。4 °C 过夜孵育。
   4. 在 4 °C 下以 2,300 × g 离心 20 分钟。
   5. 弃去上清液，将沉淀溶解于 0.5 ml TNE（10 mM Tris，50 mM NaCl，1 mM EDTA）中。
   6. 以 2,300 × g 离心 5 分钟，去除碎片。
   7. 将 0.5 ml 含重组 HBV 的 TNE 加载至 0.8 ml 20% 蔗糖（TNE 配制）上。
   8. 在 15 °C 下以 100,000 × g 离心 3 小时。
   9. 尽可能弃去上清液，保留沉淀。每 40 ml 初始培养基，将沉淀重悬于 1 ml 无血清 DMEM 中。
   10. 4 °C 过夜孵育。
   11. 通过 0.45 µm 滤器过滤。分装为 0.5 ml 每管，于 -80 °C 保存。
       注意：若观察到原始病毒样品中存在报告蛋白污染，可通过在 TNE 中进行 5–30% 蔗糖密度梯度超速离心（100,000 × g，2 小时），或在 1.1–1.6 g/ml CsCl（氯化铯）密度平衡离心中（150,000 × g，50 小时）进一步纯化病毒。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Nano-Glo 荧光素酶检测试剂	Promega	N1110
青霉素-链霉素混合溶液	Nacalai tesque	09367-34
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11995065
100 mm/胶原蛋白包被培养皿	Iwaki	4020-010
Lipofectamine 3000 转染试剂	Thermo Fisher Scientific	L3000001
聚乙二醇（PEG）6000	Sigma-Aldrich	81255
聚乙二醇（PEG）8000	Sigma-Aldrich	89510
NaCl	Nacalai tesque	31319-45
0.5 mol/L EDTA 溶液	Nacalai tesque	06894-14
Tris-HCl	Nacalai tesque	35434-21
Millex-HP，0.45 μm，聚醚砜滤器	Merck Millipore	SLHP033RS
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D2650
胶原蛋白包被 96 孔板	Corning	NO3585
HepG2-NTCP1-myc-clone22	-	-
pUC1.2HBV delta epsilon	-	-
pUC1.2HBV/NL	-	-