收获重组蛋白 埃及伊蚊 感染细胞中的浓核病毒

摘要

来源：Liu, P., et al。利用重组蚊媒浓核病毒作为基因递送载体对蚊子幼虫基因进行功能分析。J. Vis. Exp. (2017)。

本视频演示了从感染的埃及伊蚊（Aedes aegypti）上皮细胞中分离重组伊蚊浓核病毒（rAaeDV）的过程。收集感染的细胞，通过反复冻融循环进行裂解。将裂解液离心，收集含有病毒颗粒的上清液，过滤后分装，并于超低温条件下储存以备后续使用。

方案

1. 用 Aedes aegypti 细小病毒（rAaeDV）质粒转染 C6/36 细胞

1. 在含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中，于28 °C培养箱中培养C6/36细胞。
2. 第0天，将90–95%融合度的细胞按1:2稀释后接种至十个25 cm²培养瓶中，转染前培养18–20小时。
   注意：至第1天，细胞应达到90–95%融合度。
3. 第1天，用一系列rAaeDV质粒转染细胞。
   1. 在微量离心管中，将10 µg DNA溶于600 µL RPMI-1640培养基中，轻轻混匀。同时，每份转染准备600 µL RPMI-1640培养基和25 µL转染试剂。
   2. 室温（RT）孵育5–10分钟。然后，将625 µL的1640-转染试剂混合物加入RPMI-1640-质粒DNA混合物中。
   3. 该混合物于室温孵育20–30分钟。转染前，用2 mL RPMI-1640培养基洗涤细胞两次。
   4. 室温孵育后（步骤1.3.3），将RPMI-1640-转染试剂-DNA质粒混合物加入25 cm²培养瓶中，于28 °C孵育6小时。
   5. 转染后约6小时，移除转染液，用5 mL RPMI-1640培养基洗涤细胞两次，然后加入含10% FBS的RPMI-1640培养基。
      注意：rAaeDV在Ae. albopictus幼虫中感染率较高（95%）；然而，根据我们的经验，近50%的感染幼虫中，感染局限于原发感染部位（如肛乳头和刚毛细胞），未发生扩散。因此，若需在多个组织中实现感染，应共感染一种表达荧光蛋白的缺陷型重组病毒，以可视化感染位点。例如，为产生表达DsRed的缺陷型重组病毒，应将p7NS1-DsRed与辅助质粒共转染至C6/36细胞中。

2. 从转染的C6/36细胞中收获重组登革病毒颗粒（rAaeDV Virions）

1. 转染后第5天收集细胞。使用5 mL玻璃滴管，通过培养基反复吹打，使细胞脱离并悬浮于培养皿中。将所有细胞悬液转移至无菌的15 mL离心管中。
2. 在-80 °C或干冰/乙醇浴中冷冻30分钟，随后在37 °C条件下解冻。涡旋振荡1分钟。重复冻融过程3次。
3. 在4 °C条件下，以4,800 × g离心20分钟。收集上清液，弃去沉淀。随后将上清液通过0.22 µm一次性注射式滤器过滤。分装后将最终纯化的病毒颗粒储存于-80 °C。
   注意：避免反复冻融。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
离心机	Thermo Scientific	75004260
离心系统	Beckman Coulter	363118