使用硅胶离心柱从表面结合的病毒颗粒中提取病毒RNA

摘要

来源：Klaus, J. P. et al. 一种用于检测沙粒病毒与细胞结合的高灵敏度检测方法。J. Vis. Exp. (2016)

本视频演示了使用二氧化硅离心柱从上皮细胞表面结合的病毒颗粒中提取病毒RNA的方法。该方法包括化学裂解、RNA稳定化以及基于膜的纯化步骤，可用于后续对病毒与细胞结合情况进行定量分析。

方案

病毒RNA提取

1. 使用商业试剂盒从附着于单层细胞的胡宁病毒（JUNV）C#1颗粒中纯化病毒RNA例如，RNeasy Mini 试剂盒）的说明书进行操作。具体而言，遵循以下步骤 "使用离心柱技术从动物细胞中纯化总RNA的实验方案" 见《RNeasy Mini 试剂盒手册》（第4版，2006年4月）第23–28页，以下列明的修改条件为准。
   1. 通过向每个孔中直接加入350 µl RLT裂解缓冲液来裂解细胞。反复吹打数次以确保细胞充分裂解。请注意，细胞在此缓冲液中易于裂解，可通过倒置显微镜观察孔内细胞来确认裂解是否完全。
   2. 将所得的细胞裂解液转移至试剂盒柱中，并按照说明书所述完成后续步骤。此时病毒已被裂解缓冲液灭活，因此只要试剂盒管壁未被感染性病毒污染，后续步骤可在II级生物安全柜外进行。
   3. 包括制造商说明书中的可选步骤，即对离心柱进行额外离心，以消除缓冲液 RPE 任何可能的残留。
   4. 在最后一步中，按照制造商的说明书，使用 30 µl 无核酸酶的 ddH₂O 从离心柱中洗脱纯化的 RNA。₂此时可将RNA在-80 °C保存，或直接用于定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测。为防止纯化的病毒RNA样本被核酸酶降解，应使用无核酸酶的试剂和设备，并将解冻后的RNA样本置于冰上。
      注意： 缓冲液RLT和RW1含有胍盐，不得与漂白剂混合。缓冲液RW1含有乙醇。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Vero E6 细胞	美国模式培养物集存库	CRL-1586
Costar 48 孔板	Corning	3548
RNeasy mini 试剂盒	Qiagen	74106	切勿将 RLT 或 RW1 缓冲液与漂白剂混合
QIAshredder 匀浆器	Qiagen	79654
RNase 抑制剂 (5000U/100 µl)	Life Technologies	N808-0119