一种用于研究沙粒病毒与宿主细胞结合的体外实验方法

摘要

来源：Klaus, J. P., et al 测量沙粒病毒细胞吸附的高灵敏度检测方法。J. Vis. Exp. (2016)。

本视频演示了如何测量沙粒病毒与猴肾细胞的结合。该检测方法利用低温阻断内吞作用，从而分离出病毒结合步骤。该方法能够在限制病毒内化的情况下，精确量化结合于细胞表面的病毒颗粒。

方案

注意：必须严格采用预PCR技术进行本方案所述操作（有关如何建立预PCR实验室以及如何使用良好预PCR技术开展实验的全面概述）。所有试剂和设备必须不含含有qPCR靶序列的扩增DNA，并且必须设置适当的对照以检测此类污染。本方案的总体流程见图1。

1. 准备培养基并将细胞接种至48孔板

1. 通过向500 ml的DMEM培养基中加入50 ml热灭活的胎牛血清以及各5 ml的100倍浓度青霉素-链霉素溶液和100倍浓度HEPES（N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸）缓冲液，配制500 ml含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素和1% HEPES缓冲液的完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。该试剂可在4 °C保存数月。
2. 在48孔组织培养板中，每孔接种2.5 × 10⁴个Vero E6细胞，终体积为500 µl完全DMEM。将培养板置于含5% CO₂的湿润培养箱中，37 °C孵育10至18小时。
   1. 在工作日结束前完成接种。每个病毒样本设两到三个复孔进行检测。注：本实验以48孔板为基础平台进行描述，但也可将实验体系缩小，适用于96孔或384孔板。

2. 进行病毒-细胞吸附
注意： 本方案中使用的病毒为JUNV Candid #1（C#1）毒株，该毒株已被成功用作预防JUNV疾病的有效减毒活疫苗。JUNV C#1毒株系通过对强毒性的JUNV XJ毒株进行连续传代培养获得 体内 和 体外 与亲本XJ毒株相比存在12个氨基酸的差异。由于JUNV C#1被归类为生物安全等级（BSL）-2级病原体，本节所述操作必须在符合相应BSL-2级规范的条件下进行，包括使用个人防护装备（例如 眼部防护、实验服、双层手套）、II级生物安全柜，并确保所有人员均已接受机构规定的培训并获得相应批准，能够安全操作该生物体。

1. 将待检测的JUNV C#1样本用预冷的完全DMEM稀释至所需的空斑形成单位（PFUs）或焦点形成单位，并置于冰上保存，直至准备加入各孔。
   注意： 作为使用完全DMEM稀释病毒进行结合实验的替代方案，可采用含磷酸盐缓冲液（PBS）、低血清浓度（2%）及适当缓冲体系的最低限度培养基，以确定血清是否可能干扰病毒吸附。针对其他病毒的类似吸附实验方案中曾报道使用不含碳酸氢盐的罗斯威尔帕克纪念研究所（RPMI）1640培养基，其中添加0.2%牛血清白蛋白、10 mM (2-吗啉代)乙磺酸（MES）和10 mM HEPES，pH调至6.8。该结合用培养基可能更有利于防止在移除培养基后因暴露于CO₂环境所引起的pH变化。₂培养箱的环境。
   1. 接种空斑形成单位（PFU），数量控制在200至2,000之间，以减少非 productive 的吸附事件。
   2. 为接种细胞制备病毒的主混合液。每个病毒样本将以每孔50 µl的体积接种至两个复孔中。因此，若希望每孔加入2,000 PFU的病毒，则需将4,800 PFU溶于120 µl冰上预冷的完全DMEM培养基中。
      1. 为控制实验的特异性，可使用一对匹配的中国仓鼠卵巢细胞系，分别为不表达TfR1的TRVb细胞和表达hTfR1的TRVb-1细胞，因为JUNV在这两种细胞上的吸附应分别减少或不受影响。 alternatively，可用蛋白酶（如蛋白酶K）处理细胞，以阻止沙粒病毒的吸附或进入。也可考虑使用可溶性hTfR1或针对hTfR1特异的单克隆抗体ch128.1，因其已知可阻断JUNV进入细胞。此外，还可对细胞进行游离甘露糖预处理，或用JUNV特异性中和抗体孵育病毒颗粒。 可抑制病毒进入。
      2. 但请注意，尽管这些后续试剂和方法已被证实可阻断JUNV的进入，但尚未确认其是否能够阻断病毒吸附，尽管这很可能是其作用机制。本文所述的实验方案可用于正式验证这些不同方法是否影响病毒粒子的吸附过程。
2. 从37 °C培养箱中取出培养板，置于4 °C冰箱或冰上15分钟，以抑制培养板中细胞的内吞作用。
3. 接下来，吸尽每个孔中的全部DMEM，然后用100 µl冰冷的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）快速洗涤每个孔两次。随后，向相应的孔中加入50 µl预稀释的病毒样品（按步骤2.1制备）。
4. 用塑料膜包裹培养板，立即放回冰上或置于4 °C冰箱中孵育1至1.5小时，以使病毒完成吸附。此步骤中应始终保持培养板、洗涤缓冲液和病毒样品处于4 °C低温环境。
5. 4 °C孵育结束后，吸除病毒接种液，每孔用200 µl预冷的PBS洗涤3次。

结果

图1：实验流程示意图。 病毒-细胞吸附实验的主要步骤包括：1）在4 °C条件下将病毒颗粒与细胞孵育，以允许病毒与细胞发生吸附，随后通过洗涤去除未结合的病毒；2）从细胞中纯化病毒RNA；3）逆转录（RT）将JUNV S片段基因组RNA（vRNA）转化为cDNA；4）qPCR定量JUNV S vRNA拷贝数，以评估病毒-细胞吸附水平。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Life Technologies	11965-118
青霉素-链霉素	Life Technologies	15140-163	100x
HEPES 缓冲液	Life Technologies	15630-130	100x
PBS pH 7.4	Life Technologies	10010-023	1x
Vero E6 细胞	美国模式培养物集存库	CRL-1586
Corning 48 孔板	Corning	3548