使用动态光散射技术追踪病毒样颗粒的聚集行为

摘要

来源：Moore, M. D., et al. 检测病毒衣壳结构完整性的替代体外方法。J. Vis. Exp. (2017)

本视频演示了利用动态光散射（DLS）监测热诱导病毒样颗粒聚集的实验方案。首先制备纯化颗粒的单分散悬浮液，随后将样品加入预热的DLS仪器中。随着衣壳蛋白在加热过程中发生变性，暴露出的疏水区域导致颗粒发生聚集。DLS可实时检测颗粒尺寸随时间的变化，从而实现对聚集过程的实时追踪。

方案

1. 实时检测病毒聚集的动态光散射技术

注意：以下步骤可能特定于所使用的软件和仪器，但可进行调整并适用于类似设备。

1. 在动态光散射（DLS）仪器软件中创建一个新的粒径标准操作程序（SOP），参数设置如下：材料 = 蛋白质，分散剂 = 磷酸盐缓冲液（PBS），温度 = 按需设定，平衡时间 = 0 秒，样品池类型 = 石英比色皿，测量角度 = 173° 背向散射，测量时长 = 自动，测量次数 = 50（可根据聚集速率适当增加或减少），测量间延迟时间 = 0 秒，数据处理：分析模型 = 多个窄峰模式（高分辨率）。其余参数均采用默认设置。
2. 在软件中点击运行箭头，新建并命名样品文件，使仪器达到设定温度并完成热平衡。
3. 获取组装成衣壳结构的纯化人诺如病毒主要衣壳蛋白（VP1），基因型为 GII.4 Sydney（登录号：JX459908）。
   注意： 本研究中使用的衣壳由 R. Atmar（美国德克萨斯州休斯顿贝勒医学院）提供。
4. 将病毒样颗粒（VLPs）用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）在微量离心管中重悬，终浓度为 5 µg/mL，体积介于 200 - 500 µL 之间。充分涡旋混匀。
5. 将 VLP 悬液在台式离心机中离心 5 - 10 秒以脱气。此步骤有助于防止加热处理过程中产生气泡，从而干扰粒径测量。
6. 将 VLP 悬液缓慢沿石英比色皿内壁移入小体积石英比色皿中，避免产生气泡。待仪器达到温度平衡后，将比色皿插入样品室。
7. 等待 10 秒使样品温度平衡，然后开始运行。在运行开始时启动计时器，并在第一次测量结束时停止计时，将该时间记为第一个时间点。后续时间点根据软件记录的各次测量时间确定。
8. 开始运行，并监控相关图、分布拟合曲线及专家建议，以评估数据质量。
   注意： 由于样品在聚集过程中预期为多分散体系，因此多分散系数（PDI）不一定小于 0.3。
   1. 确保相关系数在短时间范围内恒定且接近但不超过 1，并在一个或多个后续时间点迅速下降，这是颗粒尺寸的典型特征。
   2. 确保分布拟合曲线与数据点高度吻合。
9. 分析粒径数据。
   1. 根据每次测量与初始时间点之间的时间差确定各个时间点。注意每次测量的持续时间并不完全相同。
   2. 基于强度分布，记录每次测量/时间点中面积最大的峰所对应的粒径。
   3. 绘制峰值直径（单位：nm）随时间（单位：min）变化的曲线图。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
纯化并组装的人诺如病毒GII.4衣壳
1× PBS（pH 7.2）	Life Technologies	20012-050
Zetasizer ZSP 或类似的颗粒大小分析仪器	Malvern Instruments	N/A
涡旋振荡器	Fisher Scientific	02-215-365
石英比色皿	Hellma	104-002-10-40
小体积一次性比色皿（以减少VLP使用量）	Malvern Instruments	ZEN0040