使用透射电子显微镜观察热处理的病毒衣壳

来源：Moore, M. D., 等．用于测定病毒衣壳结构完整性的体外替代方法．J. Vis. Exp.(2017)。

本视频展示了如何对纯化的病毒衣壳进行热处理，并利用透射电子显微镜（TEM）进行制样与成像，以揭示其结构变化及热诱导损伤。

透射电镜样品制备
1. 获取专为透射电镜设计的碳支持膜（镍）载网。
  注意：请咨询核心设施，了解推荐使用的试剂及其在该设施显微镜下的操作方法。务必将载网存放于含有干燥剂的盒子中或真空腔内，以尽量减少暴露于湿气中。
2. 撕取约 5 cm × 5 cm 的滤纸片。准备玻璃培养皿以及适用于显微镜操作的自闭合反向镊子。
3. 剪取约 2.5 cm × 5 cm 的石蜡膜片，置于实验台面上。
4. 诺如病毒 GII.4 Sydney 衣壳的热处理
  1. 获取已组装成衣壳结构的纯化人诺如病毒主要衣壳蛋白（VP1）GII.4 Sydney 株（登录号：JX459908）。
    注意： 本研究中使用的衣壳由 R. Atmar（贝勒医学院，休斯顿，德克萨斯州）惠赠。
  2. 将衣壳稀释至 10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）（pH 7.4）中，每根独立密封的聚合酶链式反应（PCR）管中体积不超过 15 µL。确保每管中含有至少 600 ng 衣壳。确保每种处理-配体组合中含有 600 ng 衣壳。
  3. 将热循环仪预热至所需的处理温度。
    注意： 本方案选择在 68 °C 下处理不同时间（0–25 分钟）。
  4. 另将一台热循环仪预冷至 4 °C 以实现快速冷却。将含有衣壳溶液的管子放入热循环仪中进行指定时间的加热处理，加热后立即转移至预冷的 4 °C 热循环仪中继续孵育 5 分钟。
  5. 短暂离心，使所有液滴沉降至管底。
  6. 用移液器将全部约 15 µL 处理后的衣壳溶液液滴转移至石蜡膜上。
5. 用镊子夹住载网边缘，使镊子闭合并固定载网，将载网碳膜面朝下放置于处理后的溶液液滴上。孵育 10 分钟，使衣壳充分吸附至载网上。
  1. 根据衣壳样品的纯度，如有需要，可在处理后的衣壳液滴后依次添加 10–15 µL 的 10 mM HEPES 溶液进行洗涤。
  2. 10 分钟后，用镊子夹起带有液滴的载网，将近乎垂直地接触一片滤纸，以吸除液滴。再用载网吸取 10–15 µL HEPES 缓冲液，保持 30 秒后，用另一片滤纸吸除液体以完成洗涤。
6. 在石蜡膜的空白区域放置一个 15 µL 的 2% 醋酸铀酰溶液液滴。
  1. 用载网吸取醋酸铀酰液滴，保持 45 秒。吸除醋酸铀酰溶液，并确保大部分液体被去除。将载网碳膜面朝上放置于一片滤纸上，注意避免载网因镊子上的湿气而“粘连”。将带有载网的滤纸放入敞口的玻璃培养皿中。
    注意：请勿使用塑料培养皿，因为载网会因静电吸附而粘附在皿上。
7. 对所有处理组重复上述步骤。将装有载网的培养皿半片置于干燥器中过夜干燥，随后进行透射电镜观察。
8. 请咨询所在机构的显微镜设施，了解已制备载网的观察事宜。部分设施允许用户接受其仪器操作培训。有关特定显微镜的设置与观察细节不在本文讨论范围之内。

姓名	公司	目录编号
透射电子显微镜样品制备
带碳支持膜的镍质电子显微镜载网	Ladd Research	10880-100
自闭型反向电子显微镜镊子	Ted Pella	5372-NM
定性滤纸	Sigma-Aldrich (Whatman)	WHA1002055
玻璃培养皿	Sigma-Aldrich	BR455743
100 mM HEPES 储存液 (pH 7.2)	N/A	N/A
2% 醋酸铀酰	N/A	N/A

使用透射电子显微镜观察热处理的病毒衣壳

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