可视化剂量依赖性刺突蛋白摄取的量子点偶联物技术

摘要

来源： Tran, B. N., et. al. 利用高通量共聚焦成像技术追踪量子点偶联的SARS-CoV-2刺突蛋白三聚体在HEK293T细胞中的结合与内吞作用。J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了利用量子点偶联的刺突蛋白（QD-Spike）在表达ACE2-GFP的细胞中可视化剂量依赖性病毒进入过程。共聚焦成像捕捉到QD-Spike通过受体介导的内吞作用被细胞内化的过程，模拟了冠状病毒早期进入细胞的机制。

方案

使用量子点-刺突蛋白（QD-Spike）处理细胞

1. 通过成像培养基稀释，制备0.1%牛血清白蛋白（BSA）。
   1. 对于10 mL成像培养基，加入130 µL的7.5% BSA并混匀。
2. 在12孔储液槽或检测板中，用含0.1% BSA的成像培养基将440 nM QD-Spike（SARS-CoV-2，分离株USA-WA1/2020）储备液稀释至20 nM。
   1. 对于1孔QD-Spike，将2.27 µL的440 nM QD-Spike加入47.73 µL的含0.1% BSA的成像培养基中，最终浓度为20 nM。
   2. 进行六点1:3倍比稀释（设三个重复），将14.26 µL的QD-Spike加入285.74 µL的含0.1% BSA的成像培养基中，得到最高浓度20 nM；将100 µL的20 nM QD-Spike加入200 µL的含0.1% BSA的成像培养基中，得到第二稀释浓度6.67 nM QD-Spike；重复此步骤四次，以获得六个浓度梯度点。
3. 使用多通道移液器吸除各孔中所有废弃培养基，再用多通道移液器加入成像培养基（100 µL/孔）清洗一次。
4. 吸除100 µL成像培养基，每孔重新加入50 µL的QD-Spike溶液。
5. 将板置于含5% CO₂、37 °C的湿润化培养箱中孵育3小时。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
7.5% 牛血清白蛋白	Gibco	15260-037	用于在Opti-MEM I中稳定量子点并防止非特异性相互作用，终浓度为0.1%
黑色透明底96孔板，聚-D-赖氨酸包被	Greiner	655946	用于细胞接种和QD-Spike检测的微孔板
HEK293T hACE2-GFP	Codex Biosolutions	CB-97100-203	稳定表达GFP标记的人血管紧张素转化酶2的胚胎肾细胞系
Opti-MEM I 低血清培养基	Gibco	11058-021	成像用培养基，用于细胞与量子点的孵育
量子点608 nm-刺突蛋白（QD608-Spike）	由海军研究实验室定制		用于检测SARS-CoV-2刺突蛋白与hACE2的结合及监测刺突蛋白内吞作用