来源：Philip, A. A., 等．表达报告蛋白的重组轮状病毒的简化反向遗传学方法．可视实验杂志（2020）
本视频展示了通过将编码轮状病毒基因组节段的质粒转染至仓鼠肾细胞中，随后在猴上皮细胞中进行扩增，从而获得重组轮状病毒的方法，该方法可用于轮状病毒生物学、复制机制及疫苗开发的研究。
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方法文章
质粒介导的培养细胞中重组轮状病毒的生成
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2026年7月31日
本文内容
摘要
方案
1. 重组病毒的制备
注意： 人类和动物轮状病毒研究，包括重组轮状病毒株的构建与鉴定，必须在生物安全二级（BSL-2）条件下进行，并需事先获得机构生物安全委员会（IBC）的批准。适当的BSL-2实验室条件在以下内容中有所描述 微生物学和生物医学实验室生物安全 （由美国疾病控制与预防中心（CDC）发布的《生物安全微生物和生物医学实验室指南》（BMBL））。
- 第1天：将BHK-T7细胞接种至12孔板
- 用 PBS（磷酸盐缓冲液）将 T75 培养瓶中新鲜汇合的 BHK（幼仓鼠肾）-T7 细胞单层洗涤 2 次。用胰蛋白酶-EDTA（乙二胺四乙酸）溶液消化细胞单层，将细胞重悬于 5 mL GMEM（格拉斯哥最低必需培养基）完全培养基中。
- 使用自动细胞计数仪和台盼蓝溶液测定培养基中BHK-T7细胞的活细胞浓度。将细胞接种至12孔细胞培养板中，每孔接种2 x 105 在1 mL GMEM（不含G418）完全培养基中重悬细胞。于37 °C、5% CO₂培养箱中培养。2 培养箱中培养。细胞应在第2天达到80−90%汇合度。
- 第2天：用质粒混合物转染BHK-T7细胞
- 准备质粒混合物时，取以下组分加入0.5 mL微量离心管中，所有质粒储备液浓度均调整为1 mg/mL：SA11 pT7质粒VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7、NSP1、NSP3和NSP4各0.8 µL，SA11 pT7质粒NSP2和NSP5各2.4 µL，以及pCMV/NP868R 0.8 µL。轻轻敲击管壁混匀质粒，并通过瞬时离心收集管壁液体。如需制备表达荧光蛋白（FP）的重组病毒，可用相应的pT7/NSP3-2A-3xFL-FP质粒替代pT7/NSP3SA11。
注意： 质粒混合物应置于冰上保存，直至使用。每次转染应准备单独的离心管。 - 为制备质粒/低血清培养基/转染试剂混合物：加入110 µL预热（37 °C）的低血清培养基（材料表) 加入每种质粒混合物中，轻轻吹打混匀。随后，加入 32 µL 转染试剂（材料表将转染试剂各 2.5 µL 加入每份质粒/低血清培养基混合物中，使混合物中转染试剂的终浓度为每微克质粒 2.5 µL。轻轻涡旋混匀，室温孵育 20 分钟。
- 在20分钟孵育期间，用2 mL不完全GMEM培养基洗涤12孔板中的BHK-T7细胞（第1天制备）一次。随后，向每孔加入1 mL不完全SMEM培养基，并将培养板放回培养箱中。
- 孵育20分钟后，使用200 µL移液器将质粒/减血清培养基/转染混合物逐滴加入12孔板的每孔中。轻轻摇动培养板后，放回37 °C、5% CO₂培养箱中2 培养箱
- 准备质粒混合物时，取以下组分加入0.5 mL微量离心管中，所有质粒储备液浓度均调整为1 mg/mL：SA11 pT7质粒VP1、VP2、VP3、VP4、VP6、VP7、NSP1、NSP3和NSP4各0.8 µL，SA11 pT7质粒NSP2和NSP5各2.4 µL，以及pCMV/NP868R 0.8 µL。轻轻敲击管壁混匀质粒，并通过瞬时离心收集管壁液体。如需制备表达荧光蛋白（FP）的重组病毒，可用相应的pT7/NSP3-2A-3xFL-FP质粒替代pT7/NSP3SA11。
- 第4天：用MA104细胞重铺转染的BHK-T7细胞
- 用 PBS 冲洗 T75 培养瓶中新鲜汇合的 MA104 细胞单层 2 次。使用胰蛋白酶-EDTA 溶液消化细胞单层，并将细胞重悬于 5 mL 完全 DMEM 培养基中。
- 使用自动细胞计数仪和台盼蓝溶液，测定培养基中MA104活细胞的浓度。将细胞浓度调整至8 × 10⁵个/mL。5 MA104 细胞/mL，加入 0.25 mL 悬浮细胞（2 × 10⁵）5 将细胞逐滴加入含有转染的BHK-T7细胞的孔中。
- 将0.8 µL浓度为1 mg/mL的胰蛋白酶（猪胰腺型IX）储备液加入每孔，使培养基中胰蛋白酶终浓度调整至约0.5 µg/mL。
注意： 胰蛋白酶储备液应使用PBS配制，分装后于-20 °C保存。 - 使用剩余的MA104细胞制备6孔板，用于第7天扩增重组病毒。接种6孔板时，将重悬的MA104细胞稀释至浓度为1.5 × 10⁵个/mL。5 细胞/mL 的完全 DMEM 培养基，每孔加入 2 mL。将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中2 培养箱
- 第7天：从转染细胞中回收与扩增重组病毒
- 将12孔板中的BHK-T7/MA104细胞在无菌条件下进行三次冻融循环，将培养板在-20 °C冰箱与室温台面之间转移。将裂解液转移至1.5 mL离心管后，以500 x g离心10分钟 g (4 °C) 离心以沉淀较大的细胞碎片。收集上清液，短期储存于 4 °C，长期储存于 -20 °C。
- 用 PBS 将 6 孔板中的 MA104 单层细胞（第 4 天制备）洗涤 2 次。每孔加入含 0.5 µg/mL 胰蛋白酶的 2 mL DMEM 不完全培养基。向各孔中加入 300 µL 从 BHK-T7/MA104 细胞裂解物中回收的上清液，并将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中2 培养箱
- 孵育平板7天，或直至观察到完全的细胞病变效应（CPE）。通过三次冻融循环裂解6孔板中的MA104细胞，然后将裂解液转移至1.5 mL微量离心管中。在500 × g条件下离心10分钟，沉淀较大的细胞碎片。 g （4 °C）。将澄清的细胞裂解物转移至1.5 mL微量离心管中，于-20 °C保存。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 幼年仓鼠肾-T7 RNA聚合酶（BHK-T7）细胞 | |||
| 一次性移液管，超细加长尖端 | MTC Bio | P4113-11 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Lonza | 12-604F | |
| 伊格尔最低必需培养基，2倍浓度（2xEMEM） | Quality Biological | 115-073-101 | |
| 无水乙醇（200 proof） | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
| 溴化乙锭溶液（10 mg/ml） | Invitrogen | 15585-011 | |
| 胎牛血清（FBS） | Corning | 35-010-CV | |
| 胎牛血清（FBS），热灭活 | Corning | 35-011-CV | |
| Flag M2 抗体，小鼠单克隆 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP 质粒中量提取试剂盒 | Sigma | NA0200-1KT | |
| 格拉斯哥最低必需培养基（GMEM） | Gibco | 11710-035 | |
| 最低必需培养基-伊格尔Joklik配方（SMEM） | Lonza | 04-719Q | |
| 猴肾（MA104）细胞 | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
| NanoDrop One 分光光度计 | ThermoScientific | ||
| Opti-MEM 减血清培养基 | Gibco | 31985-070 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS），10倍浓度 | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
| 猪胰蛋白酶，IX-S型 | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| PureYield 质粒微量提取系统 | Promega | A1223 | |
| Qiagen 质粒大提试剂盒 | Qiagen | 12162 | |
| Qiagen 质粒中提试剂盒 | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep Spin 质粒微量提取试剂盒 | Qiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 转录载体 | Addgene | 89162-89172 | |
| 表达荧光蛋白的SA11 pT7/NSP3转录载体 | |||
| 台盼蓝 | Corning | 25-900-CI | |
| 胰蛋白酶（0.05%）-EDTA（0.1%）细胞解离液 | Quality Biological | 118-087-721 |
