利用空斑试验可视化胰蛋白酶激活的轮状病毒感染

摘要

来源： Philip, A. A., et. al., 表达报告蛋白的重组轮状病毒的简化反向遗传学方法。J. Vis. Exp. (2020)

本视频演示了一种用于监测上皮细胞中轮状病毒感染的空斑检测技术。胰蛋白酶激活可增强病毒进入细胞，染色可标记活细胞，从而实现对感染诱导形成的空斑进行可视化观察。

方案

1. 重组病毒的蚀斑分离
   1. 在100 µL澄清的细胞裂解液中加入胰蛋白酶，使其终浓度为10 µg/mL，37 °C孵育1小时，以激活病毒。用不含血清的DMEM培养基将裂解液进行10倍系列稀释，稀释梯度从10^-1至10^-7（每管1 mL）。
   2. 用2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗6孔板中的MA104细胞单层2次，再用不含血清的DMEM培养基冲洗1次。将不同稀释度的裂解液各400 µL重复接种于6孔板中。将6孔板置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育1小时，每隔10−15分钟轻轻摇动一次，使接种液均匀分布于细胞单层表面。
   3. 通过将预热至37 °C的2倍Eagle最小必需培养基（EMEM）与经微波炉熔化并预冷至45 °C的1.5%琼脂糖溶液等体积混合，制备琼脂糖-MEM覆盖液。将覆盖液置于42 °C水浴中保温，并在加样前立即调整其中胰蛋白酶的终浓度为0.5 µg/mL。
   4. 吸除6孔板中的裂解液稀释液，用2 mL不含血清的DMEM培养基轻轻冲洗细胞一次。然后，每孔轻柔地覆盖3 mL琼脂糖-MEM覆盖液，确保覆盖整个细胞单层。室温下静置使琼脂糖凝固，随后将6孔板放回培养箱继续培养。
   5. 三天后，配制新的琼脂糖-MEM覆盖液并将其预热至42 °C。使用前立即向其中加入中性红，使其终浓度为50 µg/mL。
   6. 将2 mL上述覆盖液小心加至6孔板中原有琼脂糖层之上。待新的琼脂糖层凝固后，将6孔板放回培养箱继续培养。含中性红的溶液及培养板需避光保存。
   7. 在接下来的6小时内，借助透射光源观察6孔板中的轮状病毒蚀斑。使用一次性移液管挑取边界清晰的蚀斑，确保挑取的琼脂糖块完整穿透至细胞层。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
幼年仓鼠肾-T7 RNA依赖性RNA聚合酶（BHK-T7）细胞			联系人：ubuchholz@niaid.nih.gov
一次性移液管，超细延长尖端	MTC Bio	P4113-11
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Lonza	12-604F
伊格尔必需培养基，2倍浓度（2xEMEM）	Quality Biological	115-073-101
乙醇，纯级（200 proof）	Fisher Bioreagents	BP2818-500
Gibco FluroBrite DMEM	ThermoFisher	A1896701	低背景荧光的DMEM
199号培养基（M199）培养液	Hyclone	Sh30253.01
中性红溶液（0.33%）	Sigma-Aldrich	N2889-100ml
非必需氨基酸溶液（100倍浓缩）	Gibco	11140-050
磷酸盐缓冲液（PBS），10倍浓缩	Fisher Bioreagents	BP399-20
猪胰蛋白酶，IX-S型	Sigma-Aldrich	T0303
SeaKem LE 琼脂糖	Lonza	50000	用于凝胶电泳
SeaPlaque 琼脂糖	Lonza	50100	用于蚀斑试验
Zoe 荧光活细胞成像仪	Bio-Rad