通过凝胶电泳分离与可视化轮状病毒基因组

摘要

来源：Philip, A. A., 等 ，一种用于拯救表达报告蛋白的重组轮状病毒的简化反向遗传学方法。 J. Vis. Exp. (2020)

本视频演示了从澄清的细胞裂解液中分离轮状病毒双链RNA的过程，并进一步展示了通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和可视化基因组片段的方法。

方案

病毒双链RNA的凝胶电泳

1. 取600 µL澄清的感染细胞裂解液和400 µL硫氰酸胍，加入1.5 mL微量离心管中，涡旋振荡30秒，室温孵育5分钟。加入200 µL氯仿，涡旋振荡30秒，孵育3分钟。在13,000 × g（4 °C）下离心5分钟后，转移约550 µL上层水相至新的离心管中。
2. 向水相中加入2倍体积（约900 µL）预冷的异丙醇，倒置混匀4–6次，回收病毒双链RNA。室温孵育10分钟后，在13,000 × g（4 °C）下离心10分钟。弃去上清液，保留RNA沉淀。
3. 向沉淀中加入1 mL 75%乙醇洗涤，倒置一次混匀，在7,500 × g（4 °C）下离心5分钟。用移液器小心吸除乙醇洗涤液后，将RNA沉淀在实验台上空气中干燥5–10分钟。用15 µL无核酸酶的分子生物学级水溶解RNA沉淀，并于-20 °C保存。
4. 将10 µL溶解的RNA样品与2 µL 6× DNA上样缓冲液混合，上样至预制的10%聚丙烯酰胺微型凝胶（或同等手工制备凝胶），在Tris-甘氨酸电泳缓冲液中以恒定电流（16 mA）电泳分离RNA 2小时。将凝胶浸入含约1 µg/mL溴化乙锭的水中5–10分钟，使用紫外透射仪检测轮状病毒基因组片段。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Bio-Rad 8-16% Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺微型凝胶	Bio-Rad	45608105
Cellometer AutoT4 活细胞计数仪	Nexcelom
ChemiDoc MP 凝胶成像系统	Bio-Rad
氯仿	MP	194002
完全蛋白酶抑制剂	Pierce	A32965
一次性移液管，超细延长尖端	MTC Bio	P4113-11
乙醇，绝对（200 证明）	Fisher Bioreagents	BP2818-500
溴化乙锭溶液（10 mg/ml）	Invitrogen	15585-011
异丙醇	Macron	3032-02
NanoDrop One 分光光度计	ThermoScientific
无核酸酶分子生物学级水	Invitrogen	10977-015
Tris-甘氨酸-SDS 凝胶电泳缓冲液（10×）	Bio-Rad	161-0772
Triton X-100	Fisher Bioreagents	BP151-500
Trizol RNA 提取试剂	Ambion	15596026