使用定量逆转录聚合酶链式反应检测丙型肝炎病毒载量

摘要

来源：Ren, S., 等．丙型肝炎病毒复制分析方案．J. Vis. Exp. （2014）

本视频演示了使用定量反转录 PCR 对感染细胞培养物中的丙型肝炎病毒 RNA 进行定量，以测定病毒载量的实验步骤。

方案

1. 利用逆转录-定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测丙型肝炎病毒（HCV）基因组拷贝数 
   1. 采用两步法RT-qPCR测定HCV基因组RNA（核糖核酸）的拷贝数。
   2. 使用逆转录酶和特异性针对HCV正义链的引物，对1 μg总细胞RNA进行逆转录，该引物结合于5'NTR（5′非翻译区）（JFH RTQ R: 5’CCTATCAGGCAGTACCACA-3’）；或使用针对看家基因肽基脯氨酰异构酶G（PPIG R: 5’-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3’）的特异性引物。同时，使用HCV正义链引物对已知基因组拷贝数的FNX-HCV RNA（10¹至10⁹标准品）进行逆转录。
   3. 取50 ng所得cDNA（互补脱氧核糖核酸）进行qPCR，使用特异性HCV引物（JFH（日本暴发性肝炎）RTQ F: 5’CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3；JFH RTQ R: 5’CCTATCAGGCAGTACCACA-3’）以及含DNA结合绿色染料的qPCR超混合液。同时对看家基因PPIG（Peptidylprolyl isomerase G）进行qPCR（引物PPIG F: 5’-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3’；PPIG R: 5’-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3’）。
      注意：为准确计算各样本中细胞内HCV RNA水平，应以细胞看家基因PPIG的表达水平（Ct循环数）作为归一化依据。以FNX-HCV基因组的拷贝数作为拷贝数测定的标准曲线。
   4. 使用实时荧光定量PCR系统检测HCV RNA拷贝数时，采用以下反应条件：95 ºC预变性15秒，60 ºC退火延伸30秒，共40个循环。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SUPERSCRIPT III RT	Life Technologies	18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX	Life Technologies	11744500
ViiA 7 实时荧光定量 PCR 系统	Life Technologies	NA
Renilla 荧光素酶检测试剂盒	Promega	E2810
无 RNase 的 DNase	Promega	M6101
引物