通过空斑实验评估轮状病毒生长曲线

摘要

来源：Kadoya, S., Sano, D. 轮状病毒特异性生长速率和细胞结合能力的检测方法。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频演示了利用空斑实验测定轮状病毒生长曲线的方法。该方法包括用稀释的病毒侵染宿主细胞，覆盖琼脂糖以限制病毒扩散，并进行染色以观察由病毒复制形成的空斑。通过在特定时间点计数空斑形成单位，所获得的生长曲线可揭示病毒复制的延滞期、指数期和稳定期。

方案

1. 轮状病毒的比生长速率

注意：本实验方案使用恒河猴轮状病毒（RRV，基因型：G3P），因为RRV能够快速且易于在MA104细胞上形成蚀斑。 

1. 将含有1 mL病毒悬液（10⁷ pfu/mL）置于无血清培养基中，于-80 °C保存，在37 °C水浴中解冻。向1 mL病毒悬液中加入来自猪胰腺的1 µg/µL胰蛋白酶（终浓度为4 µg/mL），然后涡旋混匀。将病毒悬液在37 °C、5% CO₂条件下孵育₂ 在饱和蒸汽下处理30分钟。
   注意： 来自其他来源的胰蛋白酶也可使用，但需预先测试其对轮状病毒感染性的影响。
2. 用无血清培养基稀释活化的病毒悬液，将感染复数（MOI）调整至0.1 pfu/细胞。
3. 在细胞接种后第3天，向T75培养瓶中80%汇合度的MA104细胞系加入1 mL稀释后的病毒悬液，于37 °C孵育1小时，每15分钟轻轻摇动培养瓶一次。
4. 然后，向培养瓶中加入30 mL含有0.13 µg/mL猪胰蛋白酶的无血清培养基。将培养瓶置于37 °C、5% CO₂条件下孵育。₂ 在饱和蒸气下
5. 在感染后0、6、12、18、24和36（和/或48）小时（hpi）收集烧瓶中1 mL上清液，并用移液器更换1.5 mL离心管中的上清液。
6. 在-80 °C条件下冷冻，并在37 °C水浴中融化，重复此冻融循环三次。随后在4 °C下以12,600 x g离心10分钟，收集上清液。
7. 用经蒸馏的0.2 µm滤器过滤上清液，以去除细胞组分。将上清液于-80 °C冰箱中保存，直至用于空斑实验以测定病毒滴度。
8. 将含有收集的上清液（步骤1.5）的试管置于37 °C水浴中。向1 mL十倍稀释的样品中加入4 µg/mL胰蛋白酶，37 °C孵育30分钟。
9. 在3.8步骤的30分钟孵育期间，为开始进行噬斑试验以测定时间进程样品（步骤1.5）获得的病毒滴度，移除含血清培养基后，用2 mL 1×PBS将6孔板中的MA104细胞洗涤两次。
10. 将孵育后的样品用无血清培养基进行系列稀释，并将1 mL稀释后的样品接种至每个孔中。将培养板在37 °C、5% CO₂条件下孵育90分钟。₂ 在饱和蒸汽下，每15分钟轻轻摇动平板一次。
11. 孵育后，从6孔板中移除接种物。向步骤1.3中制备的培养基中加入4 µg/mL胰蛋白酶。立即将3 mL与琼脂糖凝胶混合的培养基（体积比为1:1）轻轻加入每孔中。
12. 将培养板在室温下放置10分钟以上（直至琼脂糖凝胶完全凝固），随后在37 °C、5% CO₂条件下孵育2天₂ 在饱和蒸气下。
    注意： 从孔的边缘倒入混有琼脂的培养基。
13. 向每个孔中加入1 mL用1×PBS稀释的0.015%中性红溶液，在37 °C、5% CO₂条件下孵育₂ 在饱和蒸汽下孵育。3小时后移除染料，于37 °C、5% CO₂条件下继续培养1天。₂ 在饱和蒸气下
14. 第二天，计数每个孔中的噬斑数量，并计算 pfu/mL。在进行噬斑实验前，仔细检查细胞汇合度，以确保噬斑数量的准确性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂-EPI	中内化学株式会社	01101-34	蚀斑实验
磷酸氢二钠	和光纯药工业株式会社	194-02875	细胞结合实验
Eagle's MEM "Nissui"	日本制药株式会社	5900	细胞培养
Eagle's MEM "Nissui"	日本制药株式会社	5901	蚀斑实验
EasYFlask 75 cm²	Thermo Scientific	156499	细胞培养
胎牛血清，经认证，符合美国农业部批准地区标准	Gibco	10437028	细胞培养与蚀斑实验
正向/反向引物	Eurofins Genomics		qPCR
L-谷氨酰胺，200 mM 溶液	Gibco	2530081	细胞培养与蚀斑实验
中性红	和光纯药工业株式会社	140-00932	蚀斑实验
PBS (-) "Nissui"	日本制药株式会社	5913	细胞培养与蚀斑实验
青霉素-链霉素，液体	Gibco	15140122	细胞培养与蚀斑实验
氯化钾	和光纯药工业株式会社	163-03545	细胞结合实验
碳酸氢钠	和光纯药工业株式会社	199-05985	细胞培养与蚀斑实验
氯化钠	和光纯药工业株式会社	198-01675	细胞结合实验
组织培养板，24孔板	TPP	92024	细胞结合实验
组织培养板，6孔板	TPP	92006	蚀斑实验
Trizma 碱	SIGMA-ALDRICH	T1503	细胞结合实验
猪胰蛋白酶	SIGMA-ALDRICH	T0303-1G	轮状病毒活化
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红	Gibco	25300054	细胞培养