利用体外全可培养病毒检测法定量水样中的感染性病毒

摘要

来源：Fout, G. S, Cashdollar, J. L. 美国环保局方法 1615：通过培养法和反转录定量聚合酶链式反应检测水中肠道病毒和诺如病毒的存在。II. 全可培养病毒检测法。可视实验杂志 (2016)

本视频演示了使用总可培养病毒检测法对水样中的感染性病毒进行定量分析。该方法包括宿主细胞接种、细胞病变效应的观察，以及感染性病毒浓度的统计学定量。

方案

1. 总可培养病毒量子测定法
注意：所有步骤中，添加溶液时均需小心，避免扰动细胞单层。 

1. 从传代后3–6天含有水牛绿色猴肾（BGM）细胞单层的试验容器中倾去或吸除培养基，然后加入与移除培养基等体积的平衡盐溶液。
2. 从所用的细胞培养试验容器中倾倒或吸除平衡盐溶液，然后接种细胞培养试验容器。
   1. 为每种测试样品接种10个测试容器，每个容器加入的子样品1体积等于接种物体积，同时设置总可培养病毒量子检测对照。
   2. 对于实验室加标空白样（LFB）和实验室加标样品基质（LFSM；即加标水相基质样品），使用子样品3和0.15 M磷酸钠缓冲液（pH 7.0–7.5）作为稀释液，分别制备5倍、25倍和125倍稀释液。除在1.2.1步骤中已接种未稀释子样品1的测试容器外，每个稀释系列还需额外接种10个经洗涤的细胞培养测试容器，每个测试容器接种指定的接种体积。
   3. 对于1.2.1步骤中的任何测试样本（1.2.2步骤接种的样本除外），若在培养14天后所有10个重复样本均出现细胞病变效应（CPE）（参见步骤1.3），则对3号子样本制备5倍、25倍、125倍和625倍稀释液。对每个稀释系列，使用接种体积向10个经洗涤的细胞培养测试容器中接种，并同时设置一组新的可培养病毒总量量子检测对照。
   4. 将接种物通过前后倾斜容器的方式均匀分布于细胞单层表面。将试验容器置于室温下，....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脱水牛肉浸膏粉末	BD Bacto	211520
Hank's 平衡盐溶液	Invitrogen	14170-112
机械摇床平台	Daigger	EF4907G
轨道摇床	Thermo Fisher	14-285-729
带预过滤器的灭菌滤器	VWR	28143-295
灭菌注射器滤器	Corning	431219
MEM 培养基	Sigma-Aldrich	M1018 或 M4642
Leibovitz L-15 培养基	Sigma-Aldrich	L4386
碳酸氢钠，7.5%	Sigma-Aldrich	S8761
胎牛血清	Invitrogen	10082-139
抗生素-抗真菌剂	Life Technologies	15240-062
胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	25200072