利用体外全可培养病毒检测法定量水样中的感染性病毒

摘要

来源：Fout, G. S, Cashdollar, J. L. 美国环保局方法 1615：通过培养法和反转录定量聚合酶链式反应检测水中肠道病毒和诺如病毒的存在。II. 全可培养病毒检测法。可视实验杂志 (2016)

本视频演示了使用总可培养病毒检测法对水样中的感染性病毒进行定量分析。该方法包括宿主细胞接种、细胞病变效应的观察，以及感染性病毒浓度的统计学定量。

方案

1. 总可培养病毒量子测定法
注意：所有步骤中，添加溶液时均需小心，避免扰动细胞单层。 

1. 从传代后3–6天含有水牛绿色猴肾（BGM）细胞单层的试验容器中倾去或吸除培养基，然后加入与移除培养基等体积的平衡盐溶液。
2. 从所用的细胞培养试验容器中倾倒或吸除平衡盐溶液，然后接种细胞培养试验容器。
   1. 为每种测试样品接种10个测试容器，每个容器加入的子样品1体积等于接种物体积，同时设置总可培养病毒量子检测对照。
   2. 对于实验室加标空白样（LFB）和实验室加标样品基质（LFSM；即加标水相基质样品），使用子样品3和0.15 M磷酸钠缓冲液（pH 7.0–7.5）作为稀释液，分别制备5倍、25倍和125倍稀释液。除在1.2.1步骤中已接种未稀释子样品1的测试容器外，每个稀释系列还需额外接种10个经洗涤的细胞培养测试容器，每个测试容器接种指定的接种体积。
   3. 对于1.2.1步骤中的任何测试样本（1.2.2步骤接种的样本除外），若在培养14天后所有10个重复样本均出现细胞病变效应（CPE）（参见步骤1.3），则对3号子样本制备5倍、25倍、125倍和625倍稀释液。对每个稀释系列，使用接种体积向10个经洗涤的细胞培养测试容器中接种，并同时设置一组新的可培养病毒总量量子检测对照。
   4. 将接种物通过前后倾斜容器的方式均匀分布于细胞单层表面。将试验容器置于室温下，在机械摇床平台上以每分钟1–5次振荡的频率孵育80–120分钟，或每15–20分钟手动摇动容器一次，以使可能存在的病毒充分吸附于细胞。
   5. 加入预热的维持培养基，然后将测试容器在 36.5 ± 1 °C 条件下孵育。
3. 每天使用显微镜观察各测试容器中细胞病变效应（CPE）的出现情况，前3天每日观察一次，之后每2至3天观察一次，直至第14天。若测试容器中出现≥75%的CPE，应立即将其转移至温度设定为-70 °C或更低的冰箱中冷冻。在最后一天完成观察后，将所有剩余培养物以及总可培养病毒量子检测试验的对照组在-70 °C或更低温度下冷冻保存。
4. 解冻所有培养物，并通过0.2 μm除菌滤器过滤每个CPE阳性测试容器中≥15%的培养基。若因滤器堵塞无法过滤规定体积，则在过滤前于4 °C、1,500–18,000 x g离心10分钟。
5. 对所有样本进行第二次传代^st 使用经洗涤的BGM测试容器传代测试容器。
   1. 将所有阴性测试容器中解冻的培养基以及阳性容器中过滤后的培养基，各取相当于其体积10%的接种量，接种至新的测试容器中。
   2. 重复步骤 1.2.4–1.4，但将任何在第 1 次检测中呈阴性的测试容器进行冷冻^st 传代并呈阳性于第2代^nd 如步骤1.3所述。执行一次3^rd 如前所述用于第2次传代的方法^nd 仅使用阴性检测对照和在第1次检测中呈阴性的细胞培养物进行传代^st 传代并呈第2代阳性^nd 传代
6. 当病毒在两种不同的测试容器中均表现出细胞病变效应（CPE）时，判定该测试容器为病毒阳性^st 和 2^nd 传代，或在CPE直到第2代才出现的情况下^nd 传代，在2^nd 和 3^rd 传代。
7. 使用美国环境保护署（USEPA）最可能数（MPN）计算器，并采用程序默认设置，计算所有测试样本的病毒滴度。
   1. 将步骤1.6中每个测试样本的病毒阳性重复检测容器数量输入计算器，以确定MPN/ml值（M_mL）以及上部（CL_μL）和较低（CL_lmL95% 置信区间/ml 值

   2. 获得MPN/L值（M_L使用公式2计算相应测试样品的）值。 

      

      M_mL 步骤1.7中的MPN/ml值，S为检测样本体积，
      其中 D 为测定所用原始水样的体积。 

   3. 将 CL 代入以计算上限置信区间/L_微升 M 的值_mL 值。通过代入置信度（CL）计算下置信限/L_lmL M 的值_mL 值。
   4. 报告 M_mL 将0值记为≤1/D。例如，地下水样品为≤0.002 MPN/L（≤1/500 L）。
   5. 通过计算器获得每毫升数值后，首先乘以 S，再将结果除以 0.3，以此计算每个实验室加标空白样和实验室试剂空白样的 MPN 及 95% 置信限值。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脱水牛肉浸膏粉末	BD Bacto	211520
Hank's 平衡盐溶液	Invitrogen	14170-112
机械摇床平台	Daigger	EF4907G
轨道摇床	Thermo Fisher	14-285-729
带预过滤器的灭菌滤器	VWR	28143-295
灭菌注射器滤器	Corning	431219
MEM 培养基	Sigma-Aldrich	M1018 或 M4642
Leibovitz L-15 培养基	Sigma-Aldrich	L4386
碳酸氢钠，7.5%	Sigma-Aldrich	S8761
胎牛血清	Invitrogen	10082-139
抗生素-抗真菌剂	Life Technologies	15240-062
胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	25200072